课件：第七章酵母拮抗菌防治水果采后病害及其作用机理.ppt

第七章 酵母拮抗菌防治水果采后病害及其作用机理 一、 拮抗菌的种类 采后生物防治的拮抗菌主要有细菌、酵母菌和小型丝状真菌。在这些拮抗细菌中，对枯草芽孢杆菌研究较多，实验证明它能有效防治柑桔青霉病、绿霉病和蒂腐病，桃，油桃，李，杏褐腐病。其它细菌如Bacillus pumilus和Bacillus Amyloliquefacients可防治梨青霉病和灰霉病。部分小型丝状真菌也被用于果蔬采后生物防治，如Lim和Tohrbock (1980)分离的Penicillum sp.可防治菠萝青霉病。,2019,-,1,由于酵母菌能在较干燥的果蔬表面生存，可产生胞外多糖加强其自身的生存能力，能迅速利用营养进行繁殖，受杀虫剂的影响较小，故近年来倍受青睐，对其研究也日益广泛和深入。 例如能有效防治苹果灰霉病的酵母拮抗菌有：Kloeckera apiculata、Candida guilliermondii, Candida oleophila , Pichia anomala , Candida sake和Candida tenuis , Cryptococcus albidus ,2019,-,2,对柑桔绿霉病有抑制效果的Candida famata； 能防治苹果、梨、草莓、猕猴桃、葡萄的灰霉病、青霉病、软腐病和黑斑病等多种病害的有Pichia membranefaciens ，Candida guilliermondii，Rhodotorula glutinis和Cryptococcus laurentii，等等。 另外，有些拮抗菌还能在多种环境下起作用，如防治草莓软腐病的Candida oleophila和Aureobasidium pullulans在果实采后，甚至在草莓盛花期、落瓣末期、果实成熟前施用，都能较好地防治灰霉病和软腐病。,2019,-,3,酵母拮抗菌次生代谢产物抑菌效果的初步研究,2019,-,4,二、 拮抗菌的使用途径 利用拮抗菌控制果蔬采后病害主要通过两种途径： 一、利用自然附着在果蔬表面生长的拮抗菌，竞争性地抑制病原菌的生长繁殖； 二、人为地引入拮抗菌来抑制病原菌。植物的叶围和根围存在着大量的天然拮抗菌，这些拮抗菌对抑制病害的发展具有不可忽视的作用。 因此，可以通过调节采前采后拮抗菌的生长环境条件，来刺激它们的生长，增强其对病原菌的抑制能力。例如，在苹果表面上喷洒L-天冬酰胺、L-天冬氨酸能促进有益菌的生长。,2019,-,5,人为引入拮抗菌用于采后果蔬的病害防治，这是目前利用拮抗菌的主要途径。与在大田进行生物防治相比，在采后应用拮抗菌防病具有独特而明显的优势： （1）果蔬贮藏环境容易控制，避免了将生防制剂施于高度变化而难于预测的环境中，而这个问题是以前大田生物防治的重要限制因素； （2）范围小而防治对象明确，拮抗菌容易击中目标病原菌，防治效率提高，同时生产成本也相对降低。,2019,-,6,三、 酵母拮抗菌生物防治水果采后病害的作用机理 一般认为，酵母菌对果蔬采后病害的作用机理主要包括以下3个方面： 1、营养或空间的竞争； 2、与病原菌的直接寄生作用； 3、诱导寄主产生抗病性。,2019,-,7,2019,-,8,1、 营养或空间的竞争 营养或空间的竞争是酵母菌产生生防作用的主要机制。当果实有伤口时，病原菌和酵母拮抗菌同时开始抢占营养丰富的伤口。由于酵母拮抗菌能在较短的时间内有效地利用果蔬伤口的营养物质而生长存活并大量繁殖，并尽可能快地消耗掉伤口营养，并占领全部空间，使得病原菌得不到合适的营养与空间条件，不能生息繁衍，从而抑制病害的发生。,2019,-,9,研究发现将季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种到桃果实的伤口处，在有病原菌存在的时候该拮抗菌的数量在24h时可以增长到200多倍。这种快速的繁殖活动反应出拮抗菌与病原菌之间的营养竞争。,2019,-,10,酵母拮抗菌与病原菌争夺的营养物质主要是碳水化合物、氮源等。研究中发现，相同浓度的拮抗菌细胞悬浮液比培养原液有更好的拮抗效果，原因很可能是培养液中的丰富营养削弱了拮抗菌与病原菌进行营养竞争的力度。 Filonow（1998）用C14标记的果糖、葡萄糖、蔗糖检验在苹果果实伤口处拮抗菌Cryptococcus laurentii与病原菌Botrytis cinerea在营养利用上的差别，发现拮抗菌比病原菌孢子消耗了更多的营养物质。,2019,-,11,2、 与病原菌的直接寄生作用 许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶，如几丁质酶、-1,3-葡聚糖酶等。这些酶是真菌细胞壁的解聚酶，参与寄主真菌细胞壁的降解，对防治病害有很大的作用。同时，一些酵母拮抗菌还可以附着在病原菌的菌丝体上，通过分泌胞外水解酶水解病原菌的细胞壁，形成对病原菌的直接寄生作用。,G,D,I,E,J,A,2019,-,12,Fan等发现，无论在体外还是体内，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)和膜醭毕赤酵母(Pichia membranefaciens)均可诱导产生外切、内切几丁质酶和-l，3-葡聚糖酶，这些水解酶可以明显地抑制病原真菌Rhizopous stolonfier孢子的萌发以及芽管伸长。,2019,-,13,Castoria等（2001）在研究Rhodotorula glutinis和Cryptococcus laurentii对苹果采后病害的防治机理时发现，病原菌Penicillium expansum和Botrytis cinerea细胞壁都可以诱导两种拮抗菌分泌胞外-1,3-葡聚糖酶。 在以P. expansum（扩展青霉）细胞壁作为碳源时，C. laurentii分泌的胞外-1,3-葡聚糖酶酶活性要高于R. glutinis，同时前者对苹果青霉病的防治效果也明显好于后者。由此可见，酵母拮抗菌分泌的胞外水解酶在其作用机理当中起着十分重要的作用。,2019,-,14,吸附作用,2019,-,15,3、 酵母菌诱导寄主产生抗病性 某些酵母拮抗菌可以诱导宿主产生具有抑菌作用的物质； 有些酵母细胞可以诱导果蔬产生几丁质酶、葡聚糖酶及其它酶类，这些酶类可以分解果蔬病原菌的细胞壁，从而抑制病原菌的生长； 还有一些酵母菌可以使宿主细胞组织结构发生变化，增加宿主的抗病能力。,2019,-,16,EI-Ghaouth等（1998）发现酵母菌Candida saitoana在苹果伤口上可以诱导宿主细胞变形，产生乳突结构，抑制病原菌的入侵。 Droby(2002)等在研究Candida oleophila对葡萄采后青霉菌的拮抗作用时发现，向葡萄果皮组织上喷施酵母细胞悬浮液可以增加乙烯的生物合成，诱导苯丙氨酸解氨酶及植保素的积累，并能增加几丁质酶、-1,3-内切葡聚糖酶的活性，从而诱导宿主产生抗性；,2019,-,17,Ippolito等（2000b）发现酵母菌Aureobasidium pullulans在苹果上可以显著提高几丁酶、-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的活性； 研究也发现拮抗酵母菌Pichia membranefaciens和Candida guilliermondii可以诱导桃产生较高水平的几丁酶和-1,3-葡聚糖酶活性，增强对软腐病的抑制效果(Fan等，2002)。,2019,-,18,第三节 酵母拮抗菌生防效力的改良 与大田农作物病害的生物防治相比，水果采后病害的生物防治是一个起步较晚但发展迅速的研究领域。拮抗菌生物防治水果采后病害要想从实验室走向生产应用，有效性和经济性是必需考虑的两个重要因素。,2019,-,19,尽管拮抗菌能防治许多水果的采后病害，但是在半商业化条件下，其防治效果不如化学防治。大规模应用中，只有当拮抗菌与低剂量的化学杀菌剂混合使用才能达到与单独使用化学杀菌剂同样的效果（EI-Ghaouth等，2000a）。因此，如何进一步提高拮抗菌对水果采后病害的抑菌力以及对水果采后贮藏环境的适应力成为目前的研究重点。,2019,-,20,一、 拮抗菌与外源物质的混合使用 在寻找新的高效拮抗菌的同时,人们也在不断地寻找能加强现有拮抗菌拮抗能力的有效途径。将拮抗菌与一些特殊的物质结合使用以提高拮抗菌的抑菌能力，就是一种简单而行之有效的途径。,2019,-,21,为了提高拮抗菌对采后苹果青霉病的生物防治效果，Janisiewicz等（1992）研究了36种碳水化合物以及23种氮化合物对病原菌Penicillium expansum的孢子萌发、芽管长度的影响以及对拮抗菌Pseudomanas syringae生长的影响。 选用那些能刺激拮抗菌的生长但对病原菌没有或只有很小刺激作用的化合物作进一步检测其与拮抗菌混合后的生防效果。 其中L-天冬氨酸和L-脯氨酸增加了拮抗菌在果实上的细胞数量，也增强了对苹果青霉的生防效果。,2019,-,22,同时，人们发现一定的盐溶液可以增强酵母拮抗菌的防治效果。经研究表明，2%的CaCl2是最为有效的盐。实验结果显示，2%CaCl2能直接抑制病原孢子的萌发及生长，并且能显著地提高酵母拮抗菌Trichosporon sp. 对苹果青霉病, Candida guilliermondii对苹果灰霉病和Pichia membranefaciens对桃软腐病的防治效果。,2019,-,23,此外，一些食品添加剂如碳酸氢钠以及钼酸铵与拮抗菌混合使用提高拮抗菌的抑菌效果，降低了拮抗菌有效防治病害的浓度，从而降低了生产成本。,2019,-,24,二、 几种拮抗菌的混合使用 在使用拮抗菌生物防治水果采后病害的时候，必须考虑到一种拮抗菌不可能有效地抑制控制一种水果上所有的病菌，这一点甚至连杀菌剂通常也未必能做到。正如Baker和Cook所说：“几种拮抗菌的混合物比单一使用一种拮抗菌进行生物防治得到成功的机会更多，同时这样的组合防治效果也比较稳定。” 其中，混合使用具有不同拮抗机理的拮抗菌进行生物防治将是一种最佳的组合方式，这种方法的使用可以减少病原菌因选择压力的存在而对一种拮抗菌产生抗性。,2019,-,25,Janisiewicz等（1988）报道了两种拮抗菌的混合物Acremonium breve和Pseudomonas sp.可完全抑制苹果灰霉病和青霉病的发生。 当然，拮抗菌的混合使用必须保证拮抗菌之间具有相容性，不会产生相互竞争，它们能够在相同的生境下能够很好的生长并发挥其拮抗效能。,2019,-,26,三、 拮抗菌与水果采后常规处理措施的综合利用 拮抗菌对于商业化处理的适应性是大力推广拮抗菌的必要前提条件。拮抗菌只有适应贮藏条件下的温度、湿度以及气体组成，才能更好的发挥其拮抗能力。 低温是水果采后贮藏必要的环境条件。但是，有的采后病原菌在零度以下的低温环境也能生长、繁殖和引起产品致病。所以生物拮抗菌对低温贮藏环境的适应能力将极大的影响其抑菌效果。因此人们开始筛选那些耐低温的拮抗菌或通过低温驯化来提高拮抗菌对低温的适应力。,2019,-,27,拮抗菌Cryptococcus albidus在1C冷藏条件下均能有效地防治苹果灰霉病和青霉病的发生，并且能够与气调贮藏相容，协同抑制病害的发生。同时，将拮抗菌与化学杀菌剂混合使用防治病害，可以提高拮抗菌的抑菌能力。,2019,-,28,拮抗菌与化学杀菌剂的配合使用，不但降低了果实上化学杀菌剂量的残留量，也降低了拮抗菌的生产成本。由此可见，在将来的生产应用中拮抗菌可与杀菌剂、低温以及气调贮藏等措施配合使用，共同防治水果采后病害的发生。,2019,-,29,四、 基因工程方法提高拮抗菌的抑菌能力 Jones和Prusky （2002）将杀菌肽A的编码基因转入啤酒酵母（Saccharamyces cerevisiae）细胞，转化子有效地抑制了毛刺盘孢属霉菌（Colletotrichum coccodes）孢子的萌发，并且有效地防治了该病原菌引起的番茄果实的腐烂。在抗真菌病害的基因工程研究中，关注最多的基因是几丁质酶基因和-1，3葡聚糖酶基因。,2019,-,30,将几丁质酶基因和-1，3葡聚糖酶基因转入拮抗菌中，可提高拮抗菌的抑菌能力。Limon等（1999）将chit33基因导人酵母Trichoderma harizanum后，其转化体产生的几丁质酶活性是野生型的200倍以上，抑菌能力大大加强。由此可见，采用基因工程的方法来提高拮抗菌的生物活性和抑菌能力是非常有效的。,Migheli, Q., Gonzlez-Candelas, L., Dealessi, L., Camponogara, A., and Ramn-Vidal, D. 1998. Transformants of Trichoderma longibrachiatum overexpressing the -1,4-endoglucanase gene egl1 show enhanced biocontrol of Pythium ultimun on cucumber. Phytopathology 88:673-677.,2019,-,31,另外，Yehuda等（2001）构建了酵母拮抗菌Candida oleophia的转化体系，为成功地将抗病基因如几丁质酶和/或-1，3葡聚糖酶基因导入拮抗菌中奠定了基础。 Flores, A., Chet, I., and Herrera-Estrella, A. 1997. Improved biocontrol activity of Trichoderma harz