课件：酸奶的制作.ppt

综合实训（一）,来的同学请先清洗自己的酸奶瓶！ 1、酸奶的制作 2、细胞破碎,微生物概述 发酵的概念 酸奶制作 细胞破碎,一、微生物概述,砧板上的微生物,一般人每个喷嚏含有约 4500-150000个病菌，而感冒病人一个喷嚏则含有高达8500万个病菌,手100-1000个/平方厘米；额头1000-100,000个/平方厘米；头皮约1000,000个/平方厘米。,皮肤、毛发上分布的细菌,卤豆腐毛霉,酸奶乳酸菌,有害真菌,微生物的概念,是存在于自然界的一群肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物（microorganism或microbe）。,微生物的共同特点 （小、多、快、强、广）,（1）体积小，面积大 （细胞以微米、纳 米来计算） （2）吸收多，转化快 （3）生长旺，繁殖快 如大肠杆菌 （4）适应强，易变异 如感冒病毒 （5）分布广，种类多,个体形态需要借助 光学显微镜或电子显微镜观察,电子显微镜,微生物的分类,非细胞型微生物 原核细胞型微生物 真核细胞型微生物,非细胞型微生物,无典型的细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长增殖。 含一种类型的核酸或遗传物质（DNA或RNA）。 是最小的一类微生物。 病 毒,15,原核细胞型微生物,有细胞结构，但细胞核呈原始状态，即环状裸DNA团块状，无核膜、核仁。 细胞器很不完善，只有核糖体；含DNA和RNA。 有6类：细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌,17,真核细胞型微生物,细胞核分化程度高，有核膜和核仁，多种完整的细胞器。 分为单细胞真菌和多细胞真菌。 真菌,真 菌,19,三大型微生物的比较,微生物与人类的关系,绝大多数微生物对人类和动植物是有益的、而且有些是必需的。 在人类社会生活的各个方面可见到微生物的参与。 微生物制药、微生物冶金、微生物治理环境、微生物食品等等。,微生物学研究的重要意义,（一）在环境中的作用 微生物在生态系统中的地位 利用微生物改善环境 微生物对环境的有害影响 （二）医药 （三）食品 （四）生物技术 （五）科学研究,微生物繁殖快、价值低，没有种族上的异议，是很好的的实验材料,分解者 微生物,消费者 动物,环境 土壤、空气、水,生产者 植物（包括部分微生物）,微生物在生态系统中的地位：,分解者，部分生产者,微生物学研究的重要意义,食品,有害影响 有利影响,引起食品酸败（发霉、变质）、 食物中毒（如肉毒芽孢杆菌、黄曲霉毒素等） 以及其他疾病。,食品微生物工程：酿酒、面包、酱油、酸奶等,二、发酵的概念,发酵是是指利用微生物的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。,酿酒、酿醋、面团的发酵、沼气的产生、垃圾的腐败,微生物学的奠基人伟大的巴斯德,1857年巴斯德（法国）证明发酵是由于微生物的作用,生产实际中，人们将通过微生物的培养，大量生产各种代谢产物的过程叫做发酵。,发酵工程的历程 1，纯种微生物的分离 2，培养技术的建立 3，密闭式发酵罐 4，发酵工程,密闭式发酵罐,发酵罐,三、酸奶的制作,（一）酸奶定义及实验原理,酸奶(yogurt)是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。,基本原理：,牛奶中的乳糖,乳酸菌发酵,乳酸,牛奶中酪蛋白,变性凝固,奶液呈凝乳状态,同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味（与形成乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸等有关）。,1.按成品的组织状态分类：凝固型、搅拌型、饮料型、冷冻型。 2.按发酵的加工工艺分类 浓缩酸乳、冷冻酸乳、充气酸乳、酸乳粉 3.按成品口味分类 天然纯酸奶、加糖酸乳、果料酸乳等 3. 按菌种种类分类 酸乳、双歧杆菌酸乳、嗜酸乳杆菌酸乳、干酪乳杆菌酸乳 等,（二）酸奶的分类,本实验主要学习凝固性酸奶的制作方法。,（三）酸奶的营养价值,营养丰富，具有鲜乳所有的营养价值，而且优于鲜乳。 调节人体肠道中的微生物菌群平衡，抑制肠道有害菌生长。,降低胆固醇水平 合成某些抗菌素，提高人体抗病能力。,缓解“乳糖不耐受症”。 有美容、润肤、明目、固齿等作用。,（四）酸奶生产用原料,主要原料： 乳、奶粉、甜味剂、稳定剂、发酵剂、香精、果料等。,1、酸乳的发酵剂菌种,根据联合国粮农组织（FAO）关于酸乳的定义，酸乳中的特征菌为 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus,2、发酵剂的概念与种类,1.乳酸菌发酵的发酵剂有三种类型： -乳酸菌纯培养物 -母发酵剂 -生产发酵剂,发酵剂（starter）：指生产发酵乳制品时所用的特定微生物培养物。,2.有时也分为混合发酵剂、单一发酵剂和补充发酵剂。,混合发酵剂 单一发酵剂 补充发酵剂 -产粘发酵剂 -产香发酵剂 -加入干酪乳杆菌,产粘、产酸程度适宜 产香性好、发酵风味柔和 保健效果好 后酸化（即酸奶的pH值继续下降，以至出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降。 ）,3、发酵剂选择标准,4、发酵剂的制备,培养基（脱脂奶）灭菌,将冻干或液体保藏菌种接入脱脂乳活化（接种量12）,下一级扩大培养（接种量23）,母发酵剂,生产发酵剂,纯菌活化扩大繁殖母发酵剂中间发酵剂工作发酵剂,将酸奶专用菌种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行混合培养，经浓缩、真空冷冻干燥制得。 可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。 接种前菌种先用少量灭菌后的水分散开再使用。菌种加入量为还原乳量的万分之一。,直投式酸奶发酵剂,实验材料 1菌种： 本实验利用含有保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)活菌的原味酸奶作为种子培养物。 2发酵培养基：160g/L全脂奶粉；30-40g/L白砂糖；pH自然。 注：全脂奶粉应不含抗生素 3器材： 无菌吸管、酸奶瓶、温度计、玻璃棒,酸奶制备实验,实验方法 器皿的清洁灭菌配制培养基接种培养品尝清洁卫生 1工艺流程： 全脂乳粉、白砂糖、水 混合均匀 灭菌(85-90，5-8min) 冷却(43-45) 接种（接入10%的原味酸奶） 封口 室温发酵12小时 冷藏(25) 成 品 2发酵培养基的消毒： 将乳粉、砂糖和水按比例混合均匀，加热至8590保持58min即可杀死病原菌和其它微生物。 3接种： 将消毒后的牛乳迅速降温至45以下，在无菌操作台上用吸管接入10的原味酸奶。 4封口、发酵： 接种后，封口后送培养箱保温发酵34h或室温发酵12h。 5冷却后熟： 经检查，酸奶已达到凝固状态(pH达4243)时，取出置4条件下冷藏24h即得成品。 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不要求，分析其原因。,实验流程图见指导材料,一、超净工作台原理,洁净室内 空气,初效过滤器,离心风机,高效过滤器,洁净工作台面,洁净工作台结构示意图,电源控制 风量调节 风压监控,净化系统,二、超净工作台配置及应用,初效过滤器,洁净工作台面,1、水平流工作台原理图,初效过滤器,高效过滤器,离心风机,洁净室内 空气,水平气流,二、超净工作台配置及应用,1 、水平流工作台介绍,初效过滤器,高效过滤器,空气净化系统,防静电亚克力,工作台控制系统,防静电万向脚轮,不锈钢台面,节能灯照明灯,电源插座,二、超净工作台配置及应用,洁净工作台面,2、垂直流工作台原理,初效过滤器,高效过滤器,离心风机,洁净室内 空气,垂直气流,二、超净工作台配置及应用,2 、垂直流工作台介绍,空气净化系统,工作台控制系统,节能灯照明灯,电源插座,初效过滤器,不锈钢台面,防静电万向脚轮,防静电亚克力,高效过滤器,手腕带插座,三、超净工作台的使用,使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。 接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰 操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。 最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 每月进行一次维护检查，并填写维护记录 。 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。 取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘、用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。,高压灭菌锅,四、细胞破碎,1、 超声波法 定义利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程 工作原理：空穴现象 特点： 适用对象一般 仅实验室中应用 细胞完全破碎 需冷却，噪音,细胞破碎方法机械破碎法,超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波破碎的机理,细胞破碎,一般认为在超声波作用下液体发生空穴化作用（ cavitation) 空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,空穴效应,当超声波作用于液体时，会使液体内部压力发生变化，产生压力或拉力，当拉力达到一定强度，可以使液体分子断裂，产生近于真空的空穴，引起空化效应（也称空穴效应）。,电声超声波发生器,超声波破碎仪,超声波破碎法应用注意事项 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。操作简单，液量损伤少。 超声波破碎法的有效能量利用率极低，处理量少 操作过程产生大量的热，因此需在冰水或有外部冷却的容器中进行。 超声处理中产生的自由基使一些敏感物质变性失活。 由于对冷却的要求相当苛刻，不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。,细胞机械破碎法,1、 化学（渗透）法 定 义采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程 原 理： 酸碱 有机溶剂 表面活性剂 螯合剂,细胞破碎方法非机械破碎法,（1）作用机理 通过改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方法称为渗透法。,（2）常用的化学试剂 有机溶剂（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性（SDS、Triton X-100)、金属螯合剂（EDTA)、 变性剂（盐酸胍、脲）等。,化学渗透法的选择取决于化学试剂的类型、细胞壁和膜的结构与类型 不同的细胞采用不同的试剂处理,化学渗透法,细胞破碎,酸碱 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。 碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。,有机溶剂 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 采用有机溶剂，例如丙酮、甲苯等使细胞脱水。如将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至20的丙酮中搅拌，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，增大细胞壁的通透性。,EDTA螯合剂：可用于处理G-，,该区域通透性增加,G-的外层膜结构,二价阳离子Ca 2+、Mg 2+与脂多糖和蛋白质的结合,EDTA,大量脂多糖分子脱落,外层膜出现洞穴,内层膜的磷脂来填补,Ca 2+、Mg 2+被螯合,表面活性剂 天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 合成的表面活性剂 离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型） 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 表面活性剂Triton X-100非离子型清洁剂 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， Triton X-100常与其它试剂混合使用。,变性剂：常用的是盐酸胍、脲。 一般认为胍能与水中氢键作用削弱溶质分子的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液（盐酸胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白）。 盐酸胍不仅能改变细胞通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白（包含体），并在其它试剂配合下，使其二硫键断裂，变性解离为亚单位。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链或肽链间的二硫键，再折叠复性成有活性的蛋白质结构。 目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli基因工程菌，渗透出重组蛋白质。,复合试剂 根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有效的提高胞内物质的释放率。 如：单独用0.1M的胍处理E. coli，可释放1的胞内蛋白，用0.5% Triton X-100可释放4胞内蛋白，二者结合使用，在同样时间内可使53的胞内蛋白释放。,一般认为胍溶解细胞外膜，使内膜暴露于Triton X-100中，双磷脂层遭受损失，结果大大改变细胞通透性。,原理,不同细胞化学渗透的处理方法,化学渗透法的优缺点（与机械法比较） 1)优点 对产物释放有一定的选择性。 化学试剂处理使一些分子量小的溶质（如肽和小分子的酶蛋白）透过，而分子量大的物质（如核酸）则被阻滞在胞内 控制条件可有选择的释出位于细胞不同部位的产物。 细胞外形保持完整，碎片少，有利于后分离。 核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取。,2)缺点 时间长，效率低。 一般胞内物释放率不超过50，处理试剂2h以上，往往还需要添加还原剂（如巯基乙醇）作保护，以防活性损伤太多。 通常为提高收率而采用较高的实际浓度，如一般用6M的盐酸胍或8M的脲来处理E.coli. 化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。 通用性差，某种试剂只用于某些特定类型的细胞。 化学法容易引起活性物质失活破坏，因此应根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件。,2、 酶解法 定义利用酶促反应分解细胞壁上的键而达到细胞破碎的过程 原理 外源性酶解溶菌酶、糖苷酶（-1,4、 1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等 内源性酶解（自溶）温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等,酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的一l，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解。对于革兰氏阴性菌需辅以EDTA。 真核细胞的细胞壁需采用不同的酶。 蜗牛酶适于酵母细胞的处理,自溶作用,通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。 自溶作用是酶解的另一种方法 微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。 改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。,应用：用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，细胞工程常用的方法。 酶溶法处理细胞存在的问题： 存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。 酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。 通用性差，不同的菌株用不同的酶。,3、 渗透压法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,细胞破碎方法非机械破碎法,4、 冻融法 处理方法： 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复进行多次此操作，使细胞受到破坏。 特点： 融化法对于存在于细胞质内、靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效。 溶质靠分子扩散释放出来，