课件：第章细胞化学染色检验血液检验.ppt

第二节 细胞化学染色检验,本节主要内容： 一、铁染色 二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色 三、过氧化物酶染色,掌握细胞化学染色临床应用 掌握各种细胞化学染色的原理及临床意义 熟悉各种细胞化学染色结果判断及正常血细胞染色反应 了解细胞化学染色的基本步骤,要求：,一、概念,细胞化学染色是细胞学和化学相结合 而形成的一门科学。它以细胞形态学为 基础，结合运用化学反应的原理对血细 胞内的各种化学物质(酶类/脂类/糖类/铁 /蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量 分析的方法。,第一部分 概 述,二、必要性,从形态学观察，存在较多的主观性； 有些原始细胞形态较相似，难以鉴别； 结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。,三、临床应用,1. 辅助判断急性白血病的细胞类型 2. 辅助血液系统疾病的诊断和鉴别 诊断 3. 观察疾病的疗效和预后 4. 疾病发病机制的探讨,白血病的诊断：MICM分型 M：morphology I：immunology C：cytogenitics M：molecular biology,形态学分型：进行初步的诊断 免疫学分型：明确细胞种类 细胞遗传学分型：与疾病预后有关 分子生物学分型：提高到分子水平,四、基本步骤,（1）物理法：干燥、火焰 （2）化学法： A、蒸气固定： B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇。,1. 固定,（1）偶氮偶联法：酯酶染色 （2）联苯胺法：POX （3）普鲁士蓝反应：Fe （4）雪夫反应：PAS （5）金属沉淀法：NAP （6）物理显色法：SBB,2. 显示：有色沉淀反应,铁染色-中性红、伊红 PAS-甲基绿,3. 复染：使各种细胞能显示出来,核：中性红、甲基绿、沙黄等。 浆：伊红、刚果红、光绿等。,第二部分 具体细胞化学染色方法,铁染色(Ferric stain),骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒(外铁)和幼红细胞(内铁)中；检测采用普鲁氏蓝反应。,一、原 理,4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)63 + 12K+ 含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁,酸性,二、结果判断,1. 细胞外铁(骨髓小粒含铁血黄素),铁颗粒、铁小珠、铁团块,细胞外铁(低倍镜观察) （）：无颗粒 （）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠 （）：有较多的铁颗粒或铁小珠 （）：有很多的铁颗粒、铁小珠 和少数铁小块 （）：有极多铁颗粒、小珠和 很多铁小块，密集成堆。,+,+,+,+,+,（1）分级(按铁颗粒数量的多少及大小) 细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。 粗大颗粒：很容易看清的颗粒。 （2）阳性率 观察100个中晚幼红细胞，计算出铁 粒幼红细胞的百分比。,2. 细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察),细胞内铁(油镜观察幼红细胞) 型：12个小铁颗粒； 型： 35个小铁颗粒； 型： 610个小铁颗粒或14个大颗粒； 型： 10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。,环形铁粒幼红细胞(ringed sideroblast) 幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕 核周1/2以上者。,铁粒幼红细胞(sideroblast)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。,铁粒红细胞(siderocyte)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。,绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞,1. 细胞外铁： （ + ） （ + ） 2. 细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约 1944%， III型（ I型为主），无 型、型、环形铁粒幼红细胞及铁粒 红细胞。,三、参考范围,四、临床意义,1. 缺铁性贫血： 外铁（），内铁10%； 治疗有效后，内外铁 。 2. 铁粒幼细胞性贫血： 外铁；内铁阳性率，环形铁粒幼 红细胞增多，可见粗颗粒的、型 铁粒幼红细胞。,3. MDS-RAS：内外铁增多，环形铁粒幼 红细胞15%。 4. 非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、 白血病等，内外铁常增多。 5. 感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等： 外铁增多。,五、应用评价,铁染色是临床常用的一种细胞化学 染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反 映机体储存铁的金标准。 外铁：反映骨髓中铁的储存量； 内铁：反映骨髓中可利用的铁量。,中性粒细胞碱性磷酸酶染色 neutrophilic alkaline phosphatase （NAP）,-磷酸萘酚钠,-萘酚+磷酸钠,NAP,PH9.6,-萘酚+重氮盐,不溶性沉淀定位于胞质,Kaplow偶氮偶联法：,一、原 理,二、正常血细胞染色反应,NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞质中。严重的化脓性感染时，晚幼阶段粒细胞也可见有阳性反应。 其他细胞基本呈阴性反应。,三、结果判断及参考范围,1. 结果判断：出现深褐色颗粒的量及密度,NAP染色反应强度标准： （）：胞质中无颗粒； （）：胞质含少量颗粒，约占1/4； （）：胞质含中等量颗粒，约占1/2； （）：胞质含较多颗粒，约占3/4； （）：胞质充满颗粒，无空隙。,+,+,+,+,+,+,EOS ,钙 钴 法,NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。 阳性率：指计数100个中性成熟粒细胞，其阳性细胞的数量即为阳性率；积分值：指计数100个中性成熟粒细胞，不同阳性程度细胞数量乘以其阳性程度之和即为积分值，其计算公式为：积分值=()数量1 +()数量2 +()数量3 +()数量4。,2. NAP染色结果报告：,3. 参考范围： 中性粒细胞NAP阳性率：40% NAP积分为： 30130分,NAP染色结果既报阳性率又报积分值。,四、临床意义,1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。,2.病理性变化： (1)NAP：细菌性感染、慢粒(加、急)、急 淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、 骨纤、真红、再障、原发性血小 板增多症、使用糖皮质激素等。,3. 疾病的鉴别：,(1) 类白与慢粒: 前者 后者 (2) 慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病： 前者 后者 (3) 细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染： 前者 后两者正常或,(2)NAP：慢粒(慢)、PNH、MDS、恶组等。,(6) 恶组与反应性组织细胞增多症： 前者 后者常 (7) 急性白血病类型： 急性髓细胞 急淋,(4) 慢粒病情观察： (5) 再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿： 前者 后者,CML,类白,五、应用评价,NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐 Kaplow萘酚AS-BI磷酸钠法和Tomonaga萘酚AS-MX 磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应 时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色 泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为 广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮 盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联 有不同的灵敏度。,过氧化物酶染色 (peroxidase，POX),一、原 理,粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于胞质内酶活性部位。,二氨基联苯胺法 二盐酸联苯胺法,二、结果判断,在细胞质内出现金黄色颗粒为阳性反应。,二氨基联苯胺法,二盐酸联苯胺法,复方联苯胺法,三、正常血细胞的染色反应,1. 粒细胞系统： 原始粒细胞（）或（+） 早幼粒以下细胞均（+），阳性逐渐增强。 中性分叶核粒细胞：强阳性 嗜酸粒细胞：阳性最强 嗜碱粒细胞：（）,2. 单核细胞系统： （）或弱（+），阳性颗粒少而细小。 3. 其它系统细胞： 淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核 细胞系统、浆细胞、组织细胞（）。,四、临床意义,主要用于鉴别急性白血病的类型 （1）急淋和急性髓细胞系的鉴别： 急淋：（），阳性率3%； 急单：弱阳性； 急粒：阳性（ + + + + ）。,ALL,ALL,原粒阴性,原粒弱阳性,原粒阳性,早幼粒 强阳性,（2）鉴别诊断： a. 小原粒（+）与原淋（） b. 急性早幼粒白血病(+)与急单（+） c. 急单（+）与组织细胞白血病、 恶性组织细胞病（）,一、原理,苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料，可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。,苏丹黑染色 （Sudan black B，SBB）,二、SBB与POX区别：,POX特异性高于SBB，而敏感性 低于SBB； 2. SBB步骤较繁琐。,过碘酸-雪夫反应(糖原染色) periodic acid-Schiff reaction(PAS),过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基的多糖类物质(糖原、糖蛋白、糖脂、粘多糖等)氧化，形成双醛基。醛基与Schiff s液中的无色品红结合，使无色品红变成紫红色化合物，定位于含多糖类的细胞内。,一、原理,1. 粒细胞系统：（阳性逐渐增强） 原始粒C（）或（+） 早幼粒C成熟中性粒C（+）： 细颗粒均匀红色 嗜酸粒C：颗粒不着色，胞质呈红色。 嗜碱粒C：颗粒阳性，胞质不着色。,二、正常血细胞的染色反应,2.单核细胞系统：分化差（）其他（+）， 细颗粒状。 3.淋巴细胞系统：多数（）少数（+）， 粗颗粒或块状。 4.红细胞系统：（），病理情况可（+）。 5.巨核细胞系统：（+），颗粒状或块状。 6.其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（+）,a 粒细胞、b 巨核细胞、c 单核细胞、d 幼红细胞,三、结果判断,1. 粒细胞系统： 红色、弥散状。,各种细胞阳性反应强弱不同,2. 淋巴细胞系统： 粗颗粒状、小块状、大块状红色。,1、+ 2、+ 3、+ 4、+ 5、,3. 红细胞系统： 均匀红色或块状,4. 单核细胞系统： 细颗粒状,5. 巨核细胞和血小板： 颗粒状、块状。,1.巨核细胞和血小板阳性,1. 帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨 髓增生异常综合征、红白血病: 前者（），后两者（+）。,四、临床意义,A 红白血病(+),B 巨幼细胞性贫血(),2. 帮助鉴别急性白血病的细胞类型： 急淋：（+）呈粗颗粒状或块状。 急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。 急单：（+）细颗粒状，均匀分布， 有时胞质边缘颗粒较粗大。,3. 其他细胞： 急慢性淋巴细胞白血病和 淋巴瘤细胞多呈强阳性 戈谢细胞呈强阳性 尼曼-皮克细胞多呈阴性,CLL,ALL,1. 特异性酯酶（specific esterase） 主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶” 氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。,一、分类,酯 酶 染 色,2.非特异性酯酶(nonspecific esterase) 单核、组织细胞中含量较多，粒细 胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑 制单核细胞中的非特异性酯酶，而不 抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。,醋酸AS-D奈酚酯酶： NAS-DAE -醋酸奈酚酯酶： - NAE -丁酸奈酚酯酶： - NBE 酸性-醋酸奈酚酯酶：ANAE (- NBE 敏感性不如NAS-DAE 但特异性较之强),（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 Naphthol AS-D chloroacetate esterase,1. 原理,氯乙酸AS-D萘酚 AS-D萘酚 不溶性的有色(红)沉淀。 NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高， 因此又称为“粒细胞酯酶”,NAS-DCE,重氮盐(坚牢蓝紫酱),氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,2. 正常血细胞的染色反应,粒系(酶活性随细胞成熟而逐渐减弱) 原粒（）或（+） 早幼粒成熟中性粒细胞（+ ） 嗜酸性粒细胞（）或弱（+） 嗜碱性粒细胞（+）,单核细胞系统： （） 肥大细胞：（+） 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、 巨核细胞、血小板： （）,3. 临床意义,主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型： 急性粒细胞白血病： （+） 急性早幼粒细胞白血病：强（+） 急性单核细胞白血病：（） 急粒单：粒细胞（+）和单核细胞（） 急性巨核细胞性白血病：（） 急性淋巴细胞白血病：（）,1. 原 理 非特异性脂酶在相应的pH环境中， 将基质液中相应底物水解，产生含萘酚 的物质，后者与重氮盐发生偶联反应， 形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质 内酶所在的部位。,（二）非特异性脂酶染色,根据pH值的不同分为： 酸性：酸性- 醋酸萘酚酯酶染色(ANAE) 中性：- 醋酸萘酚酯酶染色(- NAE) 醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE) 碱性：-丁酸萘酚酯酶染色(- NBE),-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色),-醋酸萘酚酯酶染色,a:单核 b:BPC c:巨核 d:LC(+) e:幼红(-),2. 临床意义,辅助鉴别急性白血病细胞类型 A . 急单：单核细胞阳性，能被NaF抑制。 B . 急粒：粒细胞弱阳性，不被NaF抑制。,C. M3：强阳性，不能被NaF抑制。 D. M4：部分阳性细胞能被NaF抑制， 部分阳性细胞不能被NaF抑制。 E. ALL：原幼淋阴性或阳性，不能被NaF 抑制。,氟化钠抑制：氟化钠试验的抑制率大于50%。 公式：,-醋酸萘酚酯酶染色,M5,NaF,M1,NaF,酸性-醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）-M5,3. 酯酶双染色,在同一张涂片上进行两种酯酶染色,特异性酯酶 + 非特异性酯酶,对诊断急性粒-单细胞白血病有独特价值,-NAE 与NAS-DCE 红色(单) -NBE 与 NAS-DCE 兰色(粒),NAS-DCE： M1弱(+)/M2 (+) /M3强(+)，M5/ALL()； -NBE： M5(+) NaF抑制，M1/M2/M3/ALL()； -NAE / NAS-DAE： M5强(+) NaF抑制 M3强(+) /M1M2a/ALL(+) NaF不抑制。,酸性磷酸酶染色 (acid phosphatase，ACP),一、原理,1.Gomori 硫化铅法,棕黑色,pH5.0,2. 偶氮偶联法(常用) 六偶氮付品红棕红色沉淀,磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI 棕红色沉淀,ACP,Ph5.0,重氮盐,3. 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）,两张相同标本涂片+两份基质液 (加L-酒石酸，不加 L-酒石酸),ACP染色,耐L-酒石酸 两份（+）,不耐L-酒石酸 不加 L-酒石酸（+） 加L-酒石酸（）,二、正常血细胞染色反应,粒细胞、单核细胞、淋巴细 胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、 巨噬细胞均呈阳性反应。,三、临床评价,1. 诊断多毛细胞白血病 多毛细胞白血病： （+），不被L-酒石酸抑制。 慢淋和恶性淋巴瘤细胞: （+），被L-酒石酸抑制。,多毛细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,酸性磷酸酶染色,多毛细胞白血病,多毛细胞白血病 抗L-酒石酸ACP阳性