课件：第七章蛋白质检验.ppt

1,第七章 蛋白质检验,主讲：王保平 生化教研室,2,本章内容概要：,第二节 蛋白质检验,第一节 概述,3,1、掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质（前 白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋白的 测定方法和原理。,2、熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤维蛋 白原的测定方法,3、了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液蛋白 的检测 。,本章教学要求：,4,蛋白质概念： 蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,5,第一节 概 述,机体蛋白质：,体液蛋白质的检测：,机体主要的 生物大分子,含量：人体固体成分的45%,种类：10万，30005000种/单细胞,功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等,疾病发生,体液蛋白质异常,6,要判断异常,首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点,一、血浆蛋白质的分类及功能,组成：,种类：1000种 500种 200种 含量：g mg g 来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂 除免疫球蛋白、蛋白类激素。,7,（一）血浆蛋白质的功能：,营养作用，修补组织蛋白; 维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%80%的血浆渗透压； 作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质； 运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体； 体液免疫防御系统：抗体与补体等免疫分子； 催化作用：酶的本质； 代谢调控；作为底物、酶或中间产物抑制、激活组织蛋白酶； 参与凝血与纤维蛋白溶解；除因子外均可。,8,（二）血浆蛋白质的分类：,依据来源、分离方法和生理功能,来源,肝生成：绝大多数血浆蛋白质,其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素,9,1.根据分离方法分类,盐析法：白蛋白和球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）,电泳法：,醋酸纤维素薄膜电泳：5种,琼脂糖凝胶电泳：13种,聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种,SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种,分辨率增高,-,10,2.根据生理功能分类:,11,二、血浆中几种重要的蛋白质,结构： MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。 理化性质：p4.7，肝细胞合成，半寿期12 小时。 测定方法：免疫比浊法 免疫扩散技术。,（一）前清蛋白（PA） 急性时相反应蛋白,12,功能： 营养指标（修补组织材料） 载体功能（甲状腺素维生素）。 临床意义： 营养不良和肝功能不全的敏感性升高的指标； 降低：营养不良，肝功不全， 急性炎症，恶性肿瘤， 肝硬化及肾炎时。 参考值： 200400mg/L 。,13,结构：585个aa残基构成单链多肽MW=66458，含17个二硫键。 理化性质：pI=45.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15-19 天，占总蛋白的57%68%，p7.4时带负电。 测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG）， 溴甲酚紫（BCP）,盐析等。,（二）清蛋白（ALb） 急性时相反应蛋白,14,功能：营养作用，运输作用（高亲和力），维持血 浆渗透压和正常p值。 临床意义：合成受食物影响，敏感性较低。 降低:在营养不良，肝功不全，急慢性肝疾病时; 增高:肾病综合征，少见,假性升高。 参考值：35-50 g/,15,结构：394个aa残基构成的单链多肽，含1012% 的糖 MW=5.1 万。 理化性质：pI值为4.8，占1-球蛋白区带显色的90。 测定方法：免疫化学法（常用），电泳（酸性凝胶电泳或 等电聚焦电泳），利用蛋白酶抑制能力测定等。,（三）1-抗胰蛋白酶（1-AT/AAT） 具有蛋白酶抑制的急性时相反应蛋白,16,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的p依赖性。 参考值：成人：0.831.99g/L， 新生儿：1.452.7g/L 临床意义： 升高：感染性疾病(细菌性、病毒性)、恶性肿瘤、胶原病、妊娠、外科手术、药物(雌激素、口服避孕药、肾上腺类固醇、前列腺素等)，斑疹伤寒等。 降低：1-AT缺乏症、新生儿呼吸窘迫综合征、重症肝炎、肾病综合征、蛋白丧失性胃肠症、营养不良、未成熟儿、肾移植早期排斥反应等。,17,结构：181个aa残基构成的单链多肽， MW=4万，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。 理化性质：pI 值2.73.5，肝合成，脓毒症时粒细胞和单核细胞及某些肿瘤组织也可合成。 位于1-球蛋白区带。 测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法），ELISA法等。,（四）1-酸性糖蛋白（AAG/1-AG） 急性时相反应蛋白,18,功能：与免疫防御功能有关，机制不详；抑制血小板凝集影响胶原纤维形成；参与脂类运输。 临床意义： 升高：急性炎症，组织损伤，风湿，肿瘤，AMI，溃疡性结肠炎的最可靠指标； 降低：营养不良降低, 严重肝损伤、肾病综合征、消化道疾病和雌激素作用。 参考值：.252.0g/L 。,19,结构：590个aa残基构成的单链多肽， MW=6.5万万，含4%的糖。 理化性质：pI 值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之间。胎儿肝卵黄囊合成，成人量微，升高由于肿瘤细胞合成。 测定方法： RIA、CLIA、 ELISA（常用）、 ECLIA（标本含量400g/L时 采用）等。,（五）甲胎蛋白(AFP),20,功能：胎儿血浆主要蛋白质，调节肝细胞生长和脑细胞发育；抑制细胞和体液的免疫反应；维持正常妊娠，防止母婴排斥。 参考值：20-100g/L(成人) 5g/L(新生儿) 放射免疫电泳AFP正常值：25g/L 放射免疫分析AFP正常值：20g/L 酶联免疫法AFP正常值：25g/L 最常用的定量试验为放射免疫法（正常值为025ug/L），若超过25ug/L为阳性，若再25400 ug/L之间为低浓度阳性，超过400ug/L即为高浓度阳性。,21,临床意义： 1.原发性肝癌患者诊断和鉴别（80%原发增高）,放射免疫法测得: 1.AFP大于500g/L且持续周者; 2.甲胎蛋白在200g/L以上水平持续周者; 3.甲胎蛋白由低浓度逐渐升高不降； 4.结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后即可作出诊断。,22,2.其他肿瘤时也可见增高。胃癌、肺癌、胰腺癌睾 丸、卵巢、腹膜、恶性畸胎瘤以及其他消化道肿瘤AFP 可以升高。,鉴别诊断： 正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25200g/L之间，一般在个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在 500 g/L以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。,23,3.其他疾病：病毒性肝炎、肝硬化、AFP也升高，但是95%的 患者血清AFP500 g/L,胆红素34 mol/L的患者，存活期很短； AFP急剧增长意味着肝转移； 术后AFP200 g/L，提示肝组织未完全体切除或有转移。,24,5.产前诊断： 异常妊娠，血AFP定量鉴别正常妊娠和绒癌，后者血清AFP不升高与非妊娠妇女无异。 先兆流产，部分妊娠初、中期先兆流产孕妇血清AFP值比正常孕妇低，稽留流产和自然流产孕妇血AFP值增高。 有胎块的葡萄胎，胎盘、羊水疾病可使AFP含量增高。 高危妊娠，母儿血型不合，糖尿病孕妇血清AFP增高。 无脑儿、多胎、低体重母血AFP增高。 先天性开放性神经管畸形的胎儿，母血、羊水中AFP含量异常增高，1016周孕妇血清AFP比正常高10倍，可诊断开放性神经管缺损。 死胎、胎儿窒息、胎儿低氧症，母血AFP增高，孕妇血清AFP800ng/ml预示胎儿处于危境或死亡，1075ng/ml后见流出死胎块，孕15周当母血AFP含量10ng/ml预示胎儿危险，如5ng/ml有30%胎儿未存活。 先天性食管、十二指肠、胆道闭锁，先天性皮肤缺损，肾发育不全，染色体异常，母血或羊水AFP增高，检查宜在分娩前30周进行，由于诊断可靠，可及时中止妊娠。,25,结构： 两对肽链形成四聚体，有变异体。 理化性质：胎儿胃肠道上皮组织细胞合成， NW=180KD 测定方法：ELISA法、放射免疫法、化学发光法、电化学发 光法、金标记免疫渗透法。 参考区间：健康成人3g/L, 吸烟者5g/L；,（七）癌胚抗原(CEA),26,临床意义： 1.癌胚抗原主要存在于直、结肠癌组织及胎儿肠粘膜内，CEA60g/L时，多见于结肠癌、胃癌、肺癌、胆管癌。 CEA也存在于肝癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌等肿瘤组织中。由细胞分泌产生的CEA进入局部体液及血液中，因此在上述癌症的血清及胸、腹水，消化液内可出现CEA的异常增高。肺癌的胸水CEA往往高于血清。 2.CEA持续升高，表明有病变残存或疾病有进展。肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等患者血清CEA也会升高。大多显示为浸润型肿瘤，其中70%为转移性肿瘤。,27,3.其他疾病 如：良性肿瘤、炎症和退行性疾病（结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎、酒精性肝硬变、活动性肝病等）部分病人的含量也可增高，但其值远低于恶性疾病，一般小于20g/L。对于一些难以鉴别的病例可做动态观察，其值逐渐上升或持续高水平则良性的可能性较小。 如：其他体液的CEA检测也用于诊断之中。胰液、胆汁、尿液等。胰液和胆汁内的CEA可用于诊断胰腺和胆道癌；尿液CEA作为判断膀胱癌预后的灵敏指标。,28,29,结构： 两对肽链形成四聚体，有变异体。 理化性质：肝合成， pI 值为4.1，电泳位a2 -球蛋白区带 测定方法：电泳法，免疫化学法（扩散,浊度）,化学法等,（七）结合珠蛋白(Hp) 急性时相反应蛋白,30,功能： 与红细胞中释出自由Hb 结合,防止Hb 从尿中丢失保存铁, 急性溶血后一周再生恢复。 高效的过氧化物酶。 需铁细菌的天然抑菌剂。 参考值：0.5-2.2 g/L， 新生儿为成人的10%-20%。,31,临床意义：正常参考值范围较宽，因此一次测定的价值不大，连续观察可用于监测急性时相反应和溶血是否处于进行状态。,升高：急性时相反应； 1.肝外阻塞性黄疸血清中Hp含量正常或提高;2.创伤、烧伤;3.恶性肿瘤;4.急慢性感染;5.结核病;6.风湿病，如风湿性、类风湿性关节炎、红斑狼疮;7.冠心病;8.肾病综合征;9.内分泌失调者，使用避孕药或类固醇药物者;10.正常妊娠妇女。 降低：1.临床上测定Hp主要用于诊断溶血性贫血。各种溶血性贫血Hp含量都明显减低，甚至低到测不出的程度。轻度溶血时，血浆中游离Hb全部与Hp结合而被清除，此时血浆中测不出游离Hb，仅见Hp减少。当游离Hb量超过Hp结合能力时方被查出。因此，Hp降低可作为诊断轻度溶血的一项敏感指标。2.急、慢性肝细胞疾病Hp降低(如肝炎)。3.传染性单核细胞增多症、先天性无结合珠蛋白血症Hp可下降或缺如。4.急、慢性感染，组织损伤，恶性疾病等也可增高。5.巨幼细胞性贫血。,32,结构： MW=6280 万,分子量最大，由四个相同的亚基组成，含糖量约。 理化性质：肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期5 天。 测定方法：免疫化学等。 参考值：1.31-2.93g/L,（八）2-巨球蛋白(AMG/2-MG),33,功能：AMG与多种分子和离子结合，影响蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制剂具有选择性保护某些酶的作用）。 临床意义：婴幼儿及儿童是成人的2-3倍； 升高：低白蛋白血症（代偿，保持血浆渗透压）；妊娠、口 服避孕药、雌激素、慢性肾炎、肝脏疾病、糖尿病、自身免疫性疾病也可使其升高。 降低：DIC、胰腺炎及前列腺癌时。,34,结构： MW=12-16 万, 1046个aa残基构成的单链多肽，含糖约，每分子铜蓝蛋白可结合个铜原子。 理化性质：肝合成,巨噬细胞和淋巴细胞合成少量；pI 值为4.4， 具遗传基因多态性， 稳定性较差，标本采集后应 尽快测定，长期应保存在-70。 测定方法：免疫化学（扩散或比浊）等。,（九）铜蓝蛋白(CER/CP) 急性时相反应蛋白,35,功能：具氧化酶活性且起抗氧化剂作用，铜的无毒代谢库。 参考值：0.21-0.53g/L 临床意义： 增加：急性时相反应蛋白，在感染,创伤,肿瘤时升高，4-20 天达峰值; 降低：营养不良、严重肝病、肾综、妊娠期、口服雌激素等可见降低，也可协助诊断Wilson 病。,36,结构： MW=7.7 万,单链糖蛋白，含糖约。 理化性质：肝细胞合成， pI 值为5.5-5.9,半寿期7 天，可逆结合多价离子如Fe,Cu,Zn,Co 等，一分子TRF 可结合两个三价铁。 测定方法：放免法和散射免疫比浊法等。,（十）转铁蛋白(TRF) 急性时相反应蛋白,37,功能：运输铁。 临床意义：血TRF 浓度受铁供应调节，缺铁TRF 升，铁治疗后恢复。可用于贫血的诊断和对治疗的监测。 降低:负急性时相反应、慢性肝病、营养不良及蛋白丢失时； 升高：妊娠、雌激素、避孕药会使其降低;缺铁性低色素贫血。 参考区间： 28.651.9mol/L,38,结构： MW=11800， 100个aa残基构成的单链多肽，分子中含一对二硫键，不含糖。 理化性质： pI 值为5.7，淋巴细胞合成，存在细胞表面，特别是淋巴和肿瘤细胞。释放入血循环。半衰期107 分钟，几乎由肾小管回收。 测定方法：放射免疫化学等。,（十一）2 微球蛋白(BMG),39,功能：分子量小，可自由通过肾小球滤过膜，在肾小管几乎全部重吸收，可监测肾小管功能；是HLA链的轻链部分。 临床意义：增高：肾功能衰竭，炎症及肿瘤时。 参考值：1.0 2.5 mg/L （血浆）,40,结构： MW11.5-14 万，分子含个相同的亚基，亚基间靠非共价键连接成圆盘状多聚体。 理化性质：肝合成， pI 值为6.2，电泳位于 r 区带。 测定方法：半定量沉淀法（早），放射免疫法、免疫浊度法、ELISA。,（十二）C-反应蛋白质(CRP) 急性时相反应蛋白,41,功能：结合多糖，磷脂和核酸；激活补体，抗凝。 参考值： 8.0mg/L （血浆） 临床意义：第一个认定的急性时相反应蛋白,是急性时相反应的一个敏感指标，在、创伤、感染、炎症、外科手术肿瘤浸润时含量在6-12小时迅速升高，达到正常的2000倍。 风湿病急性期和活动期CRP升高； 术后CRP不降或再次升高，提示合并感染和血栓。 CRP明显升高提示病情活动期。,42,三、疾病时血浆蛋白质的变化,急性时相反应蛋白：在炎症、创伤、感染、心肌梗塞、 肿瘤等情况时，有些血浆蛋白质含量会增高，有些会降低， 这种现象称为急性时相反应。浓度增高的血浆蛋白质被称为 急性时相反应蛋白 (APP）。浓度降低的血浆蛋白质被称为 负相急性时相反应蛋白 。,（一）炎症、创伤,43,急性时相反应机制： 当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。,急性时相反应的应用： 急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关，可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。,44,急性时相反应蛋白分类：,升高：AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、Fib、CRP； 降低：PA、Alb、TRF。,45,46,肝是合成多数血浆蛋白质的主要器官，因此肝疾病可以影响到很多血浆蛋白质的变化。血浆蛋白质大多数由肝脏合成，因此肝脏疾病可导致多种血浆蛋白质发生变化。 如乙肝活动期AAT，IgM在发病初期即可增高，Hp、PA、Alb，特别是血浆PA的含量是肝功能损伤的敏感指标。 肝硬化时AAT、IgA、AMG，CER、CRP，而AAG、Hp、C3，PA、Alb、TRF、1-LP 。,47,肾脏疾病可出现蛋白尿而导致血浆蛋白质丢失，丢失的蛋白质与其分子量有关。小分子量蛋白质丢失最明显，而大分子量的蛋白质因肝细胞代偿性地合成增加，绝对含量升高。所以血浆Alb、PA、AAG、AAT、TRF，而AMG、-LP、Hp、IgM ，这称为选择性蛋白质丢失。 当严重肾病是肾小球失去分子筛作用，可导致非选择性蛋白质丢失，表现为广泛地低血浆蛋白质血症。,48,（四）风湿病： 炎症主要累及结缔组织，但可伴有多系统的损害。 风湿病可表现急性或慢性炎症过程，包括多方面的变化。 患者血浆蛋白的异常改变主要包括急性炎症反应和由于抗原刺激引起的免疫系统增强的反应，其特征为： 免疫球蛋白升高，特别是IgA，并可有IgG及IgM的升高； 炎症活动期可有1-AG、Hp及C3成分升高。,49,（五）血浆蛋白质的遗传性缺陷 包括个别蛋白质发生变异或其量的完全缺乏与基本缺乏。这一现象多数是由于编码的相应蛋白质基因发生遗传上的突变或缺失。举例如下： 11抗胰蛋白酶缺乏病，患者血浆中1-AT可仅为正常的10%，是常染色体的隐性遗传。杂合子患者血清中1-AT含量也低于正常。由于1-AT占1区带中蛋白质的大部分，这种异常在血清电泳中可以初步识别。进一步作免疫化学检查可确诊。 2结合珠蛋白缺乏病。 3转铁蛋白缺乏病，为常染色体显性遗传。 4铜蓝蛋白缺乏病，为常染色体隐性遗传。,50,5补体成分缺失，少见。患者完全缺乏某种补体成分，对感染的易感性增加。 6免疫球蛋白缺乏，可表现为反复感染，可有一种或多种免疫球蛋白的缺陷。如无球蛋白血症或低球蛋白血症，全部免疫球蛋白组分均可降低。 7无白蛋白血症，为极罕见的遗传病，完全缺乏时患者可以不发生严重症状，这是由于球蛋白代偿性的增加。,（五）血浆蛋白质的遗传性缺陷,51,1.各种血浆蛋白质的合成、降解、转换更新和代谢调节。 2.各种血浆蛋白质生理功能的进一步研究。 3.血浆蛋白质的遗传变异，通过它了解人群与家族遗传特征。 4.以新技术对血浆蛋白质进行微量和特异检测分析。 5.在进化与个体发育的生化研究中，发现不少正常胎儿期蛋白可以在恶 性肿瘤病人重新出现。 6.血浆蛋白质在实际工作中广泛用于组织与细胞培养。 7.在动脉粥样硬化及肿瘤等发病学研究中对血浆蛋白质有广泛涉及。,血浆蛋白质的研究在以下几个领域进展迅速：,52,53,现代蛋白质检验四大功能：,54,第二节 蛋白质检验,总蛋白测定,个别蛋白质的测定,蛋白分离测定技术,发展趋势:,测定体液标本:,血浆：普遍,尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查,55,免疫化学法特异定量个别蛋白质,体液蛋白质的测定方法概括：,常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法。 微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（EIA/ELISA）,56,电泳测定：,定量化学测定TPr，Alb,电泳 组成图谱 半定量 定量,染料结合法，UV法，折光法等,57,一、血清总蛋白测定,假设：,、纯多肽链，含氮量平均为16 % 。 、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量。,58,测定依据：利用蛋白质以下的结构或性质,1、元素组成测定：含N稳定； 2、重复的肽链结构：具有多个肽键； 3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收； 4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接； 5、沉淀后借浊度测定：光度计测定； 6、光折射测定：折射仪测定。,59,方法：,1.凯氏定氮法参考方法 2.双缩脲法( 推荐) 3.酚试剂法 4.散射比浊法 5.染料结合法 6. UV 法 7.折光测定法,60,1.凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro),消化 用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏 用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收 用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+ ） 滴定 用已标定的无机酸滴（使H+ 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。,原理：,61,评价：,优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。 缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。,应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法,62,2.双缩脲法,原理：,蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。,双缩脲生成,63,评价：,优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%2%，显色稳定。 缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。,应用：常规推荐方法。手工或上机使用。,64,3.酚试剂法,原理：,蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。,Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。,65,评价及应用：,优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。 缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。,66,4.比浊法,原理：,评价及应用：,优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）,某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。,67,5.染料结合法,在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。,原理：,常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等,评价及应用：,优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。 缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易 确定。,68,6.紫外分光光度法,蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260,原理：,69,评价及应用：,优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。 缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。 措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。,70,7.折光测定法,溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。,原理：,评价及应用：,优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。 缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。,71,【临床意义】 （一）血清总蛋白增高 1. 血液浓缩 严重腹泻 、呕吐、高烧。 2. 合成增加 主要见于球蛋白合成增加，多发性骨髓瘤等。 （二）血清总蛋白降低 1.血液稀释 静脉滴注过多低渗液，各种原因所引起的水钠潴留。 2. 摄入不足和消耗增加 营养不良，慢性胃肠道疾病引起的消化 吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲亢、恶性肿瘤。 3. 合成障碍 主要见于肝脏疾患。 4. 蛋白质丢失 严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。,72,二、血清清蛋白测定,方法：,1.染料结合法( 推荐) 2.盐析法 3.电泳法 4.免疫化学法,73,1.染料结合法( 推荐),原理: 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。（BCG、BCP）,溴甲酚绿（BCG）在pH4.2的环境中，在有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，可与清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一不定范围内与清蛋白含量成正比。 BCG与清蛋白结合的特异性较低，它不仅与Alb结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中1-球蛋白、TRF、Hp最明显，但反应速度不同，Alb可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。,74,染料,BCG,BCP,优点,缺点,易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差,与非人源性白蛋白结合力弱 与白蛋白结合特异性好,在30秒内测可提高特异性,75,应用及评价:,严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动化分析。临床上推荐使用。,76,盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。 各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。,2.盐析法,中性盐：硫酸铵、硫酸钠等,77,应及评价:,操作繁琐，精密度不好， 不宜自动化，基本不用。,78,3.电泳法,操作：,醋纤膜电泳,染色,晾干,透明,光密度仪扫描,洗脱,比色,染色,分离,测得蛋白组分百分比,计算得出各种蛋白质含量,半定量,定量,79,评价及应用：,优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌。,缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料 亲和力高会导致结果偏高。,80,4.免疫化学法,原理及特点:,应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多。,测定血清白蛋白的免疫化学法,81,参考范围:成人3448g/L。,临床意义：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿 先天性ALB缺乏病,真性升高：未见,假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白,82,三、血清球蛋白测定,方法：,间接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸 紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反应:,参考范围: 成人2030g/L. A/G：1.52.5/1,83,临床意义：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成减少、低或无-球蛋白血症,真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反 应、MM、巨球蛋白血症。,假性升高（少见）：机体明显失水。,84,白球比正常值： 白蛋白要高于球蛋白，A/G正常值范围在1.5-2.5之间波动。 原因：当白球比A/G小于1.5时（也有很多以小于1为标准），这时被称为白球比倒置或白球比偏低。而在这个时候也就预示着肝脏已经受到了严重的损伤。 处理方法：白球比倒置的患者需要结合病史、症状等找出白球比倒置的原因，比如乙肝患者的白球比倒置，需要检查HBVDNA、肝胆B超、肝纤四项等，根据检查结果了解白球比倒置的原因，针对病因进行治疗。,85,四、脑脊液蛋白质测定,脑脊液蛋白质 来源:,外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的低 分子量蛋白质,占血清蛋白质1%以下。,内源:由中枢