课件：第章基因工程改.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 十 四 章,第 二 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,重组DNA技术的发展史,1973年 美国斯坦福大学的科学家构建 第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 1999年 我国首例携带人血清白蛋白基因整合的转基因试管公牛滔滔在沪诞生,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),基因工程,是指在体外人工将目的基因和载体进行重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。,基因工程(genetic engineering),目的 获得目的基因的多拷贝 （DNA） ( DNA克隆) 获得目的基因的表达产物（蛋白质）,基因工程实际上是一种“超级显微工程”： 对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。 要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。 还要将目的基因与载体连接起来。 DNA重组技术的发明有赖于工具酶的发现,一、重组DNA技术中常用的工具酶,1、宿主的限制与修饰现象 限制:实际就是限制性核酸内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。,修饰:宿主细胞通过甲基化作用达到保护自身DNA的作用,2、限制性核酸内切酶,定义 指识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类 型：限制酶、甲基化酶、ATP酶、解螺旋酶 型：限制酶 型：限制酶、甲基化酶,（基因工程技术中常用型）,限制性核酸内切酶,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),特异识别连续的4、6或8个碱基: 出现的几率分别是1/44、1/46、1/48 识别序列越长、切点越少。,虞美人 【宋】王文甫 顺读：黄金柳嫩摇丝软，永日堂空掩。 卷帘飞燕未归来，客去醉眠倚枕殢残杯。 眉山远拂青螺黛，整整垂双带。 水垂香熨窄衫轻，莹玉碧溪春溜烟波横。 倒读：横波烟溜春溪碧，玉莹轻衫窄。 熨香垂水带双垂，整整黛螺青拂远山眉。 杯残殢枕倚眠醉，去客来归未。 燕飞帘卷掩空堂，日永软丝摇嫩柳金黄。,Bam H,切口 ：粘端切口,Hind,切口 ：平端切口,几种不同的末端,5突出粘端（EcoR）,3突出粘端（Pat）,平头末端（Hind）,限制性内切核酸酶,同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,Bam H,Bg l,+,+,同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,二、基因载体,定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,克隆载体(cloning vector) 为使插入的目的基因被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的目的基因可表达成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 最少需要启动子,理想载体的选择标准,能自主复制； 有遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 常具有多个酶的单一酶切位点，称为多克隆位点； 表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、增强子等。,1. 质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状（如抗药性等）。,质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,pBR322质粒DNA,2019/8/23,25,可编辑,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,2. 噬菌体(phage),pUC19 2686bp,Gsul 1874,Ctr 101 1779,Ppal 1766,Amll 806,Xmnl 2294,Scal 2177,Spal 2501,Aatll 2617,EcoO1092674,0,Ndel 183,Narl 235,LacZ,EcoRI Sacl Kpnl Smal Xmal BamHI Xbal HincII PstI SphI HindIII,pUC噬菌体,筛选标记的依据： pUC的LacZ基因： 半乳糖苷酶片段（N末端） 宿主： 半乳糖苷酶 片段（ C末端） 同时表达，才有半乳糖苷酶的活性，使特异的作用物（X-gal）转变为蓝色。 若目的基因插入pUC的LacZ基因： N末端片段无法生成，宿主无半乳糖苷酶活性 X-gal培养呈白色。,互补,利用-互补筛选重组体pUC18,3. 粘性质粒(柯斯质粒,cosmid),COS,Hind ,Bam H ,Eco R,Eco R,PJB8 kb,Pst ,Sal ,质粒+噬菌体。具有二者的双重特性,其它载体,1） 酵母人工染色体载体（ yeast artificial chromosome YAC）：大容量的载体。 2） 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 3） 病毒改造的载体： 真核重组及其表达载体、基因治疗载体。 DNA病毒：SV40（猴肾病毒）、痘苗病毒。 RNA病毒：反转录病毒、植物病毒。 昆虫病毒：具宿主专一性强特点，能表达原核与真核两类基因。,质粒,限制性酶切,限制性酶切,含目的基因的外源DNA,DNA连接酶,目的基因,重组质粒,受体菌,转化或转染,非转化菌,含重组体转化菌,筛选,阳性菌落扩增,副本,培养液中繁殖后在 固体培养基中培养,三、基因工程的操作过程,（一）目的基因的获取,1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应( PCR),（四）外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,（三）限制性核酸内切酶的应用,Bam H切割反应,同一限制酶切位点连接,目 录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,目 录,目 录,2. 平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3,3 5,5 3,3 5,5 3 A(A)nA,A(A)nA 3 5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶 + dATP,末端转移酶 + dTTP,3. 同聚物加尾连接,Eco R,Eco R,4. 人工接头(linker)连接,受体菌条件 安全宿主菌 ：限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(具备接受外界DNA 能力),导入方式 转化 ：外源DNA进入原核细胞 转染 ：外源DNA进入真核细胞 感染 ：通常侧重指技术手段,（五）重组,（六）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法) 抗药性标记选择,目 录,利用-互补筛选重组体pUC18,尼龙膜,记号孔,核酸探针原位杂交杂交筛选,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,（七）克隆基因的表达,优点：简单、省时、省钱 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶