课件：二蛋白质化学forgraduaescandidaes.ppt

第二章 蛋白质化学,(Amino Acid),一、蛋白质的概念与生物学意义 Protein, Pr 结构组分 简单蛋白、缀合蛋白（辅基/配基/配体） 功能物质 酶、调节、转运、贮存、收缩、支架,（糖、脂、核酸、蛋白质）,二、氨基酸蛋白质的构件分子,（一） 氨基酸的一般结构,（二） 氨基酸的分类,（三） 氨基酸的基本性质,构 成 Pr 的 20种基本AA都是-氨基酸 -C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸,结构通式,含有氨基和羧基,（二）氨基酸的分类,根据R基极性,非极性R基AA： Ala、Val、 Leu 、Ile、 Pro、Phe、Trp、Met,不带电荷极性R基AA： Gly、Ser、 Thr 、Tyr、 Cys、Asn、Gln,带正电荷R基AA：Lys、Arg、His,带负电荷R基AA：Asp、Glu,不常见的蛋白质AA（修饰、衍生而来）,Pr合成时参入,非蛋白质氨基酸（ 、D-型AA ）,下列氨基酸中侧链含有羟基的是 ( )。 A. Gly B. Glu C. Lys D. Thr,下列含有两个羧基的氨基酸是 ( )。 AArg BLys CGly DTrp EGlu,含硫氨基酸包括： AMet BThr CHis DCys,芳香族氨基酸是： APhe BTyr CTrp DPro,下列哪些是碱性氨基酸： AHis BMet CArg DLys,蛋白质分子组成中不含有下列哪种氨基酸？ ACys BMet C胱氨酸 D瓜氨酸,侧链含有咪唑基的氨基酸是（ ）。 A、Met B、 Cys C、 Arg D、His,下列哪一种氨基酸是先以其前体形式结合到多肽中， 然后再进行加工形成的 A.脯氨酸 B.赖氨酸 C.羟脯氨酸 D.谷氨酸,生物体内的氨基酸有D-型和L-型两种，其中D-型氨基酸通常存在于( )中。 A.胰岛素 B.抗菌肽 C.细胞色素 D.血红蛋白,蛋白质中不存在的氨基酸是( )。 A.Cys B.Hyp C.Cit D.Met E.Ser,1. 氨基酸的酸碱性质,兼性离子,质子供体,质子受体,（两性电解质）,（三） 氨基酸的基本性质,氨基酸的等电点,溶液为某一pH时AA主要以兼性离子形式存在 分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0 这一pH值即为AA的等电点（pI） pI时AA在电场中,既不向正极也不向负极移动,不同pH条件下两性离子的状态变化,pH pI 净电荷 +1 0 -1 正离子 兼性离子 负离子 等电点PI,当AA处于等电点时（中性AA）：,R+,R0,R-,-H+,-H+,pH = pK平衡1 + lg R0 / R+ pH = pK平衡2 + lg R- / R0,侧链不含离解基团的中性AA pI = (pK1 + pK2 )/2,pI取决于兼性离子两侧pK值的算术平均值,pI取决于兼性离子两侧pK值的算术平均值 酸性AA：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2,pI取决于兼性离子两边pK值的算术平均值 碱性AA：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,谷氨酸有3个可解离，其pK1=2.19, pK2=9.67, pK3=4.24,它的等电点是（ ）。 A. 3.22 B. 5.93 C. 6.43 D. 6.96,精氨酸的pk1=2.17，pk2=9.04（-NH2），pk3=12.48（胍基），其pI=（ ）。 A. 1/2 (2.17+9.04) B. 1/2 (2.17+12.48) C. 1/2 (9.04+12.48) D. 1/3（2.17+9.04+12.48）,分子中含有两个不对称碳原子的AA是（ ） A. Pro B. Tyr C. Thr D. Arg,pH为8时，荷正电的氨基酸为（ ）。 A. Glu B. Lys C. Ser D. Asn,甘氨酸是乙酸甲基上的氢被氨基取代生成的，为什么乙酸羧基的pKa是4.75，而甘氨酸羧基的pKa是2.34 ?,当Gly溶液的pH低于6.0时，氨基以带正电荷的形式存在，带正电荷的氨基通过静电相互作用（诱导效应）使羧基更容易失去质子，成为更强的酸。,Ala，Ser，Phe，Leu，Arg，Asp，Lys 和His的混合液中pH3.9进行纸电泳。哪些向阳极移动？哪些向阴极移动？为什么带相同净电荷的AA如Gly和Leu在纸电泳时迁移率会稍有差别？,Ala, Ser, Phe和Leu pI (6): 带净正电荷，阴极 His, Lys, Arg pI大于7: 带净正电荷, 阴极 （带的正电荷多，能和其他阴极移动的AA分开） Asp pI是3.0，带负电荷，阳极移动,带有相同电荷AA，MW大的移动速度较慢: 电荷/质量的比小，单位质量受到的作用力小,2. 氨基酸的化学反应,（1）-NH2参加的反应,（2）-COOH参加的反应,（3） -NH2和-COOH共同参加的反应,（4） 侧链R基参加的反应,（1）-氨基参加的反应,与亚硝酸反应,与酰化试剂反应,烃基化反应,形成Schiffs碱反应,（DNFB、PITC）,保护氨基,NH2 OH R CH COOH + HNO2 R CH COOH+H2O+N2 Van Slyke 法测氨基氮（体积）的基础 N2中的1/2为氨基氮,O COONa 在弱碱中 CH2 O C Cl + H2N CH 后酸化 R O COOH CH2 O C N CH +Na+Cl- H R,苄氧酰氯,苄氧酰氨基酸,氨基酸氨基的保护措施,弱碱性,DNP-氨基酸 （黄色）,DNFB,Sanger 法测定N末端氨基酸基础,pH8.3,无水HF,苯异硫氰酸酯PITC,苯氨基硫甲酰衍生物,苯乙内硫脲衍生物,Edman降解法基础,R COOH R COO C=O + H2N CH C=N CH H R H R,醛 氨基酸 Schiffs碱,-H20,+H20,（2） -羧基参加的反应,成盐或成酯反应,成酰氯反应,脱羧基反应,叠氮反应,保护羧基,活化羧基,活化羧基,形成胺,*与NaOH等形成盐 *成酯 NH2 干燥，HCl R CH COOH + C2H5OH 回流 R CH COOC2H5 + H2O,NH3Cl,保护羧基,HN-保护基 R CH-COOH + PCl5 HN-保护基 R CH-COOCl + POCl3 + HCl,保护氨基 活化羧基,NH2 脱羧酶 RCH-COOH R-CH2-NH2 +CO2,YNH O NH2NH2 RCHCOCH3 YNH O HNO2 RCHCNHNH2 YNH O RCHCN -N+ N + 2H2O,酰化氨基酸甲酯,肼,酰化氨基酰肼,酰化氨基酰叠氮,活化羧基,（3） -羧基和-氨基都参加的反应,成肽反应,茚三酮反应,（氨基酸残基）,弱酸 加热,Pro和Hpro无游离氨基，只能形成黄色化合物（440nm）而不是紫色化合物（570nm） 可鉴定某化合物是否有可能是AA,（4） 侧链R基参加的反应,含硫AACys,Cys的氧化,Cys与金属离子结合,二硫键的打开,巯基能与各种金属离子形成稳定程度不等的络合物，使酶失活。,（对氯汞苯甲酸）,Cys的巯基不稳定，易被氧化成二硫键,二硫键可被氧化剂（过甲酸）及还原剂（巯基化合物）打开,磺基丙氨酸,二硫苏糖醇,巯基乙醇,所有-氨基酸都有的显色反应是 ( )。 A. 双缩脲 B. 茚三酮 C. 坂口反应 D. 米伦反应,AA与亚硝酸反应所释放的N2气中，AA的贡献是（ ） A. 25% B. 50% C. 80% D. 100%,寡肽或多肽测序时下列试剂中最好的是（ ）。 A. DNFB B.肼 C. 苯异硫氰酸酯 D. 丹磺酰氯,氨基酸不具有的化学反应是（ ） A.肼反应 B.PITC反应 C.茚三酮反应 D.双缩脲反应,3. AA的光学活性和光谱性质, AA的光学活性,除甘氨酸外，19种AA都具有旋光性 除胱氨酸和酪氨酸，其余AA都能溶于水,氨基酸的光谱性质,可见光区：无吸收 远紫外和红外区：都吸收 近紫外区（200-400nm）：Tyr/Trp/Phe 原因：-C=C-C=C-C=C-C=C-,Trp 280nm Tyr 275nm Phe 257nm,蛋白质含量测定,下列氨基酸中 TD=0的是 （ ）。 A. Gln B. Glu C. Gly D. Ile,构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸？ A. L- AA B. L- AA C. D- AA D. D- AA,280nm波长处有吸收峰的氨基酸为（ ）。 A.精氨酸 B.色氨酸 C.丝氨酸 D.谷氨酸,下列AA在生理pH范围内缓冲能量最大的是（ ） A. Gly B. His C. Cys D. Asp,试命名下列氨基酸（均存在于蛋白质中） 用强酸或强碱处理能转变成存在于Pr中的另一种AA。 空气中即可氧化为存在于蛋白质中的另一种氨基酸。 能在279nm强烈吸收紫外光，易为强酸所破坏。 在pH6pH8内有缓冲能力。 与茚三酮反应生成一种黄色产物。 其水溶液无旋光性。,Gln/Asn,Cys,Trp,His,Pro,Gly,（一）肽的概念及理化性质,（二）蛋白质的初级结构,（三）蛋白质的高级结构,三、蛋白质的结构与功能,（四）蛋白质结构与功能的关系,（peptide）,（一）肽的概念及理化性质,聚合反应： AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成酰胺键,肽键,形成的化合物称肽,氨基端或N-端、羧基端或C-端 AA残基顺序：从N-端开始以C-端结束 Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（方向性） Gln-Asp-Tyr-Val-Ser,蛋白质和多肽中连接AA残基的共价键： 肽键、二硫键,首尾缩合成环,蛋白质和多肽中连接AA残基的共价键：,形成二硫键,蛋白质与多肽无严格界线 通常将6000Da以上的多肽称为蛋白质 不同蛋白质分子量变化范围很大,蛋白质月示 胨 多肽 肽 AA 1104 5103 2103 1000 200-500 110,AA的平均分子量：128,1. 肽和肽键的结构,AA残基间以肽键相连肽 肽键的性质,C-N键有部分双键性质 键长及键角一定 以反式结构存在 组成肽键原子处于同一平面（肽平面）,2. 肽的理化性质,等电点（两性）,酸碱性质取决于： -羧基、-氨基、侧链基团的解离,具有双缩脲反应（CuSO4碱性溶液） 肽和蛋白质所特有（紫红色）,脑啡肽 激素类多肽、抗生素多肽 谷胱甘肽 细胞内重要的还原剂,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,天然存在的重要多肽,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH （CH2）2 CH2 HCNH2 SH COOH 还原型谷胱甘肽,Glu-Cys-Gly SH 还原型谷胱甘肽,在下列有关谷胱甘肽的叙述中正确的是( )。 A. 谷胱甘肽中含有胱氨酸 B. 谷胱甘肽是体内重要的氧化剂 C. 谷胱甘肽谷氨酸的-羧基是游离的 D. 谷胱甘肽的C-端是主要的功能基团,还原型谷胱甘肽分子中的肽键有何特点？ 还原型与氧化型谷胱甘肽的结构有何不同？,（二）蛋白质的一级结构,共价结构包括： 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链内/间二硫键的数目和位置 多肽链的氨基酸顺序(最重要),多肽链的拆分,几条多肽链借助非共价键连接在一起（寡聚蛋白）,8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍,断开二硫键:,在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下 用过量-巯基乙醇处理,烷基化试剂保护巯基，防止重新被氧化,二硫键还原为巯基,酸水解,常用6M盐酸或4M硫酸 优点：水解产物不消旋 缺点：Trp被沸酸完全破坏 含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解,氨基酸组成分析,碱水解,一般用5M氢氧化钠 缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化 优点：Trp不受破坏,氨基酸组成分析,末端氨基酸残基测定,氨基酸排列顺序测定,N末端测定,2，4-二硝基氟苯（DNFB）法,丹磺酰氯（DNS）法,氨肽酶法,C末端测定,肼解法（氨基酸酰肼）,羧肽酶法,Sanger法,还原法（硼氢化锂）,Edman法（PITC）,N-端分析法 特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman法,肽段氨基酸序列的测定,（苯异硫氰酸酯法）,无水,氨基非质子化,PITC,PTC-肽,酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性裂解,肽链,水解位点,胰蛋白酶：R1=Lys、Arg,胰凝乳蛋白酶：R1=Phe、 Trp、Tyr,胃蛋白酶： R2Phe、Trp、Tyr、 Leu、Val,R2=Pro（抑制）,葡萄球菌蛋白酶： R1Asp、Glu,溴化氰： R1Met,胰蛋白酶专一水解多肽键中（ ）。 A. 碱性残基N端 B. 酸性残基N端 C. 碱性残基C端 D. 酸性残基C端,下列叙述中不属于蛋白质共价结构内容的是（ ）。 A.多肽链中AA残基的种类、数目、排列次序 B.多肽链中AA残基的键链方式 C.多肽链中主肽链的空间走向，如-螺旋 D.胰岛分子中A链与B链间含有两条二硫键，分别是 A7-S-S-B7，A20-S-S-B19,蛋白质水解,肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解 得到AA的混合物 酶水解一般是部分水解 得到多肽片段和AA的混合物 氨基酸是蛋白质的基本结构单元,氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。 自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构 胰岛素： A链：21个AA B链：30个AA 两个链间二硫键 一个链内二硫键,常用的试剂：CNBr，尿素，-巯基乙醇，胰蛋白酶，过甲酸，丹磺酰氯，6mol/L HCl，茚三酮，异硫氰酸苯酯和胰凝乳蛋白酶等。为完成下列各项试验，请回答每项的最适试剂是什么？ （1）一个小肽的氨基酸顺序的测定 （2）多肽链的氨基末端的测定 （3）一个没有二硫键的蛋白质的可逆变性 （4）芳香族氨基酸残基的羧基一侧肽键的水解 （5）甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解 （6）通过氧化途径将二硫键打开,过甲酸,异硫氰酸苯酯,丹磺酰氯,尿素,胰凝乳蛋白酶,CNBr,蛋白质可与碱共热水解，虽然这个过程会破坏一些AA， 但它却被常用来定量蛋白质的( )。 A. Ser B. Cys C. Thr D. Trp,如果一个肽用末端检测方法测定不出它的末端， 这个肽只能是个环肽?,蛋白质三维结构,二级结构,三级结构,四级结构,超二级结构和结构域,（三）蛋白质的高级结构,构 型：原子的连接方式,构 象：原子的空间排布,键 能 肽键 二硫键 离子键 氢键 疏水键 范德华力,数量巨大,1、二级结构,指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠 只涉及主链构象及链内/间形成的氢键 -螺旋、 -折叠、-转角、无规卷曲,共价主链,相邻的肽平面构成两面角,多肽链：通过可旋转的C连接的酰胺平面链,酰胺平面与碳原子的二面角,螺距0.54nm 每圈含3.6个AA残基 每个AA残基占0.15nm 链内氢键与轴平行 多为右手螺旋,（1）-螺旋（3.613螺旋）,第n个AA和第n+4个AA的 C=O和NH间形成氢键,R基大小：较大的难形成，如多聚Ile R基的电荷性质：不带电荷易形成 Pro吡咯环:无法形成链内氢键,影响-螺旋形成的因素,其他类型：310螺旋、螺旋（4.416）,肽链在回折转弯时，转弯处常是Pro或Gly,下列因素中主要影响蛋白质-螺旋形成的是（ ）。 A.碱性AA的相近排列 B.酸性AA的相近排列 C.脯氨酸的存在 D.甘氨酸的存在,多肽链形成-螺旋时，主要靠哪种次级键维持（ ）。 A.疏水键 B.肽键 C.氢键 D.二硫键,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间氢键交联而成 肽链主链呈锯齿状折叠构象,（2） -折叠,C位于折叠的棱角 AA的R基处于折叠的棱角上，并与之垂直,几乎所有肽键都参与链内氢键的交联,氢键与链的长轴接近垂直,反平行,平行,作用力：氢键 只形成,O （ 氢 键 ） H C（NHCHCO）2N R,（3） -转角,肽链主链骨架180的回折结构 特点： 由4个连续的AA残基组成 第一个残基C=O 第四个残基NH,形成氢键,泛指不能归入明确的二级结构 如折叠片和螺旋的多肽片断。,（4）无规卷曲（random coil）,-螺旋: 1951年, Pauling L.和Corey R.等,-角蛋白:典型的-螺旋（头发）,-角蛋白:典型的-折叠(丝心蛋白),由360个AA残基形成的典型-螺旋，其螺旋长度是: A. 54nm B. 36nm C. 34nm D. 15nm,-转角主要存在于球状蛋白分子中， 多数处在Pr分子表面。,2019/8/27,89,可编辑,维持蛋白质二级结构的主要化学键是： A.盐键 B.疏水键 C.肽键 D.氢键 E.二硫键,维系蛋白质一级结构的化学键是 ( )。 A.盐键 B.二硫键 C.疏水键 D.肽键 E.氢键,蛋白质分子中-螺旋构象的特征之一是( )。 A.肽键平面充分伸展 B.多为左手螺旋 C.靠盐键维持稳定性 D.氢键的取向几乎与中心轴平行,2、超二级结构与结构域,（1）超二级结构 若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的 二级结构组合单位。,（2）结构域 二级/超二级结构基础上形成的特定区域 局域分别折叠比整条肽链折叠 在动力学上更为合理 结构域间由肽链连接 有利于结构的调整,3、蛋白质的三级结构,由二级结构元件构建成的 包括主链和侧链构象在内的 总三维结构 维系力：氢键/疏水键/离子键/范德华力,球状蛋白质三维结构的特征,含多种二级结构元件,三维结构具有明显的折叠层次,分子是“紧密”的球/椭球状实体,疏水核和亲水膜,表面空穴,营造疏水环境、活性功能部位,4、蛋白质四级结构,由多条各自具有一、二、三级结构的肽 链 通过非共价键连接起来的结构形式 包括各亚基的： 种类、数目、空间排列方式 亚基间的相互作用关系,单 独 亚 基 无 生 物 功 能,亚基,血红蛋白,血红蛋白,四亚基1 、2、1、2,亚基：具有独立三级结构的肽链,研究对象：几个亚基，是否相同？ 怎样连接？,稳定四级结构的作用力： 结构互补（极性）和非共价键 离子键和氢键缔合的专一性 疏水相互作用驱动缔合,在蛋白质和核酸分子测序方面作出突出贡献且获得 诺贝尔奖的科学家是（ ）。 A. J. Watson B. F. Sanger C. L. Pauling D. J. Sumner,球状蛋白分子含有极性基团的氨基酸残基在其内部，所以能溶于水。 蛋白质的亚基和肽链是同义的。 疏水作用是使蛋白质立体结构稳定的一种非常重要的次要键 。,蛋白质分子中个别氨基酸的取代未必会引起蛋白质活性的改变 。 二硫键和蛋白质的三级结构密切相关，因此没有二硫键的蛋白质就没有三级结构。,不参与维系蛋白质三级结构稳定的因素是（）。 A.范德华力 B.离子键 C.氢键 D.肽键 E.疏水作用,每个蛋白质分子必定有( )。 A.-螺旋 B.-折叠结构 C.三级结构 D.四级结构 E.辅基或辅酶,关于蛋白质结构的叙述，哪项不恰当（ ）。 A.胰岛素由两条肽链构成，是多亚基Pr，具四级结构 B.蛋白质一级结构中包含有高级结构的信息 C.非极性AA侧链的疏水性基团，避开水相、相互聚集的倾向对多肽链在二级结构基础上按一定方式进一步折叠起着重要作用 D.亚基间空间排布是四级结构的内容，亚基间非共价缔合,有关亚基的描述，哪一项不恰当（ ）。 A.每种亚基都有各自的三维结构 B.亚基内除肽键外还可能会有其它共价键存在 C.一个亚基（单位）只含有一条多肽链 D.亚基单位独立存在时不具备原有生物活性,关于可溶性Pr三级结构的叙述，哪一项不恰当（ ）。 A.疏水性氨基酸残基尽可能包裹在分子内部 B.亲水性氨基酸残基尽可能位于分子内部 C.羧基、氨基、胍基等可解离基团多位于分子表面 D.Phe、Leu、Ile等残基尽可能位于分子内部,在pH7的水溶液里，在典型的球状蛋白分子中，处于 分子的内部的AA残基经常是（ ）。 A. Glu B. Phe C. Thr D. Asn,蛋白质空间构象主要取决于 ( )。 AA的排列顺序 B.次级键的维系力 C.链间二硫键 D.温度、pH值和离子强度等 E.链内二硫键,下列具有四级结构的蛋白质是( )。 A纤维蛋白 B.肌红蛋白 C.清蛋白 D.乳酸脱氢酶 E胰岛素,在有关蛋白质三级结构的描述中, 错误的是( )。 A. 具有三级结构的多肽链都有生物学活性 B. 三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构 C. 三级结构的稳定性由次级键维持 D. 亲水基团多位于三级结构的表面 在有关蛋白质四级结构的描述中, 正确的是( ) A. 蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系 B. 四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件 C. 蛋白质都有四级结构 D. 蛋白质亚基间由非共价键聚合,（四）蛋白质的结构与功能的关系,1、肌红蛋白的结构和功能,2、血红蛋白的结构和功能,3、血红蛋白分子病,4、蛋白质的AA序列与生物功能,1、肌红蛋白的结构和功能,三级结构,myoglobin，Mb,血红素辅基,丙酸基,乙烯基,乙烯基,甲基,甲基,甲基,甲基,丙酸基,血红素辅基亚铁原卟啉,O2与Mb的结合, Mb的氧结合曲线（双曲线）,MbO2,Mb+O2,氧合Mb,去氧Mb,氧合Mb与去氧Mb的浓度比与氧浓度成正比,2、血红蛋白的结构和功能,结构,肌红蛋白 血红蛋白 血红蛋白,(R) relaxed state,(T) tense state,血中氧分子的运送：,静脉,动脉,环境氧高时 Hb 快速吸收氧分子,环境氧低时 Hb 迅速释放氧分子,释放氧分子后 Hb 变回 T state, Hb结合氧的调节,a. H+、CO2促进O2的释放,碳酸酐酶,pH降低时：促进氧的释放、缓冲血液pH 波尔效应（Bohr效应）,CO2与Hb的结合,氨甲酸血红蛋白,释放的H+有助于Bohr效应 氨甲酸可形成额外的盐桥：稳定T态 促进氧的释放,b. BPG降低Hb对氧的亲和力,2，3 - 二磷酸甘油酸 Hb异促别构调节的效应物,Hb有一个BPG结合部位于4个亚基缔合形成的中央空穴内,离子键稳定T态,hemoglobin fetal HbF ( 22 ) 对氧的亲和力比成人高 Ser取代His，与BPG结合减弱,血红蛋白的氧合曲线向右移动是由于（ ）。 A. O2分压的减少 B. CO2分压的减少 C. CO2分压的增加 D.pH值的增加,关于Hb和O2结合的叙述，错误的是（ ）。 A. Hb的4个亚基间有协同作用 B. 1个分子Hb最多结合4分子O2 C. Hb和O2的结合和解离曲线呈S形 D.100ml血中的Hb实际结合的O2量称为Hb氧容量,3、血红蛋白分子病 分子病：由于基因突变，导致蛋白质中氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。 镰刀型贫血症（sickle-cell anemia）,患者缺氧窒息,正常细胞 镰刀形细胞,正常型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys - 链 谷氨酸 镰刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys - 链 缬氨酸,（极性） （非极性）,N,影响去氧Hb的溶解度,纤维状沉淀,4、蛋白质的AA序列与生物功能 同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质： 来自不同生物体 执行相同 /相似功能的蛋白质 同源蛋白的AA序列具有明显的相似性,不变残基（黄色）保守残基（蓝色）,Conservation and variation of cytochrome c sequences,细胞色素C与系统树,狗 人 猴,马 骡,鲸 兔 猪,袋鼠,企鹅,鸡 鸭,响尾蛇,龟,苍蝇 蛾,脉孢菌属,念珠菌属,面包酵母菌,小麦,牛 蛙,金枪鱼,动 物,爬行动物,两栖动物,鱼,哺乳动物,鸟,昆 虫,植 物,脊椎动物,从细胞色素C的一级结构看生物进化,简述蛋白质的一级结构与生物进化的关系（8分）,答案要点： (1)Pr一级结构指蛋白质多肽链中AA残基的排列顺序。 (2)不同物种同源蛋白质一级结构存在差异: 亲缘关系越远，其一级结构中AA序列的差异越大； 亲缘关系越近，其一级结构中AA序列的差异越小。 (3)与功能密切相关的AA残基是不变的，与生物进化相关的AA残基是可变的。,蛋白质的功能是由空间构象决定的。 蛋白质空间构象由关键部位的AA顺序决定。 关键部位氨基酸的变化会引起功能发生变化。,四、蛋白质的理化性质,（一）相对分子量 （二）两性解离及等电点 （三）胶体性质 （四）紫外吸收特征 （五）变性及复性,（280nm）,（一）Pr相对分子量的测定,1. 凝胶过滤法,只适于球状蛋白质分子 且不与凝胶发生相互作用 需要几种已知斯托克半径的标准蛋白,2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,蛋白质电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状,十二烷基硫酸钠,变性,？,迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量,巯基乙醇破坏二硫键,3. 沉降速度法,密度梯度（区带）离心 S：单位离心场的沉降速度 多用于标准蛋白分子量测定,4.根据化学组成测定最小分子量,测定Pr中某微量元素含量(如 Fe) 假设Pr中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100 55.8/铁的百分含量,例1：测得一种血红素蛋白含0.426%的铁， 计算其最低相对分子量。 最低相对分子量= =55.8/0.426%=13098,铁的百分含量,铁的原子量55.8,例2： 一种纯酶按其重量计算含有： 1.65 % 亮氨酸和2.48 % 异亮氨酸， 计算该酶的最低分子量。,Ile:Leu = 2.48 % : 1.65 % =1.5: 1= 3 : 2 1.65 % = 2 (131 Da -18) / 蛋白质MW 或 2.48 % = 3 (131 Da -18) / 蛋白质MW,（二）两性解离及等电点 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 等电点（pI平均在 6.0 左右）,（三）胶体性质,胶体溶液：质点大小在1-100 nm范围所构成的分散系统。 Pr: 2-20nm,蛋白质胶体溶液的稳定因素： 同种电荷相互排斥 水化膜,蛋白质溶液： 丁达尔效应、布朗运动 不能通过半透膜,胶体溶液稳定因素被破坏：蛋白质沉淀 可逆沉淀： 条件温和，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 非变性沉淀 盐析法、有机溶剂沉淀法、pI沉淀法等,不可逆沉淀 强烈沉淀条件 不仅破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等,盐析法 中性盐脱去蛋白质的水化层、中和电荷,有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数 等电点沉淀,等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶 原因？,盐溶盐析,盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？,蛋白质沉淀，常选用硫酸铵 优点： 1. 溶解度大，对温度不敏感 水温25，饱和溶解度为4.1M 水温0，饱和溶解度为3.9M 2. 分级效果好，去杂75%以上 3. 有稳定蛋白质结构的作用 经2-3M硫铵盐析的Pr可低温保存1年以上 缺点：继续纯化时，需脱盐。,盐分级沉淀,重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态,（四）紫外吸收特征 用于蛋白含量的测定,（五）变性/复性,引起生物功能丢失的三维结构改变（变性）,肽链未必完全伸展或构象无序化,实质：次级键（非共价键）被破坏,变性蛋白质特点 A.生物活性丧失 B.侧链基团暴露:易与化学试剂反应 C.理化性质改变: 疏水基外露溶解度 分子相互凝集，形成沉淀 D.生化性质改变：结构伸展易被酶解,何谓Pr变性与复性？变性Pr发生哪些性质上的变化？,变性：Pr的次级键破坏,天然结构解体,引起生物活性丧失,溶解度降低以及其它理化常数改变，但一级结构没有变化。,A.生物活性丧失 B. 侧链基团暴露:更易与化学试剂反应 C. 理化性质的改变:疏水基外露,溶解度降低 D.生物化学性质的改变，分子结构伸展，易被酶解,复性：当变性因素除去后，变性Pr重新回复到天然结构的现象（ 吴宪）,蛋白质变性过程中与下列哪项无关（ ）。 A.理化因素致使氢键破坏 B.蛋白质空间结构破坏 C.疏水作用破坏 D.蛋白质一级结构破坏，分子量变小,加入下列试剂不会导致蛋白质变性的是（ ） A.尿素（脲） B.盐酸胍 C. SDS D.硫酸铵,变性蛋白质的主要特点是： A粘度下降 B溶解度增加 C不易被蛋白酶水解 D生物学活性丧失,蛋白质变性是由于 ( )。 蛋白质一级结构的改变 B.亚基解聚 C. 辅基脱落 D. 发生水解 E. 空间构象的破环,五、蛋白质的分离与纯化,（一）抽提原理及方法 （二）纯化方法：电泳、离心、层析 （三）定量方法,（一）蛋白质分离纯化的一般原则,总目标：增加制品纯度或比活 1. 前处理：因来源而异（释放活性物质） 2. 粗分级：盐析/等电点/有机溶剂沉淀 3. 细分级：凝胶过滤、离子交换/吸附/亲和层析 4.结晶是最后步骤,（二）蛋白质的分离纯化方法,1. 根据分子大小差异 透析和超过滤、凝胶过滤 2.利用溶解度差别 等电点沉淀、盐析、有机溶剂分级分离 3.根据电荷不同 凝胶电泳和等电聚焦,等电聚焦电泳,双向电泳,4. 离子交换层析,5. 亲和层析,SDS凝胶电泳测定Pr的相对分子质量是根据各种Pr（ ）。 在一定pH值下所带净电荷的不同 B .分子大小不同 C. 分子极性不同 D. 溶解度不同,分析下列4个肽的混合物，在Dowex-1（一种阴离子交换树脂）的离子交换柱上以从pH101.0连续变化的缓冲系统作洗脱，试说出每种肽洗脱的相对次序。 A. 赖-甘-丙-甘 B. 赖-甘-丙-谷 C. 谷-甘-丙-谷 D. 组-甘-丙-谷,A B D C,用重金属沉淀pI为8的Pr，该溶液的pH值应： A. 8 B. 8 C. 8 D. 8 E. 8,盐析沉淀蛋白质的原理是( )。 A.中和电荷，破坏水化膜 B.与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 C.降低蛋白质溶液的介电常数 D.调节蛋白质溶液的等电点,例：用硫酸铵分离血清白蛋白和球蛋白 实验原理： 在一定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗粒失去电荷和水膜，沉淀析出 所获得的沉淀保留Pr原来的性质,球蛋白不溶于半饱和的硫酸铵溶液(析出) 白蛋白则溶于半饱和的硫酸铵溶液 白蛋白不溶于饱和硫酸铵（析出）,凯氏定氮法,（三）蛋白质的定量方法,Folin-酚试剂法（Lowry法）,双缩脲法,紫外吸收法,染料结合法（Bradfold法）,Pr平均含氮量16%（6.25