课件：二蛋白质.ppt

第 二 章 蛋白质,掌握内容：,蛋白质元素组成及其特点； 蛋白质基本结构单位-氨基酸的种类、基本结构； 氨基酸在蛋白质分子中的连接方式； 蛋白质的分子结构； 蛋白质的主要理化性质,熟悉内容：,蛋白质的生物学重要性；氨基酸的理化性质；蛋白质与氨基酸的分类；蛋白质的提取与纯化的原理,了解内容：,胶原蛋白的分子结构；蛋白质结构与功能的关系,蛋白质(protein)是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子化合物。,蛋白质概述,Fireflies: luciferin+ATP,Erythrocytes: hemoglobin,Hair, scales, horn: keratin,分布广：蛋白质是生物体基本组成成分，人体内几乎所有器官、组织都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是体内最丰富的生物大分子，约占人体干重的45。,蛋白质是生物体重要组成成分,1）参与组织细胞的生长、更新和修补。 2）参与催化、运输、免疫保护、代谢调节等过程 3）氧化供能,2. 蛋白质具有重要的生理功能,蛋白酶的催化作用,氢化酶是自然界厌氧微生物体内存在的一种金属酶,apoB100,胆固醇脂,磷脂,游离胆固醇,载脂蛋白运输脂类物质,低密度脂蛋白转运内源性胆固醇,免疫球蛋白的免疫保护作用,免疫球蛋白与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害。,氧化供能,乙酰CoA,TAC,2H,呼吸链,H2O,ADP+Pi,ATP,CO2,阶段I,阶段II,阶段III,第 一 节,蛋白质的基本组成单位 -氨基酸,蛋白质的元素组成,主要有C、H、O、N和S。,特征性元素：N,平均为16，即每100g蛋白质含16g氮,100克样品中蛋白质含量（克） 每克样品中 含氮克数6.25100,一、氨基酸的结构和分类,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,-氨基酸的立体异构体,组成天然蛋白质的氨基酸均为L-型,氨基酸的分类,这20种氨基酸都具有特异的遗传密码，故称为编码氨基酸 。,非极性疏水性氨基酸 极性疏水性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,根据侧链基团（R）在中性溶液中的极性和解离状态，20种氨基酸分为4类：,氨基酸的分类,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,二、氨基酸的理化性质, 两性解离与等电点,氨基酸含有氨基（碱性）和羧基（酸性）在溶液中可两性解离。,等电点(isoelectric point，pI),在一定pH值的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的程度相同，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,溶液pH值与氨基酸等电点的关系,(二）氨基酸的紫外吸收性质和呈色反应,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm波长附近具有最大的光吸收峰。,苯丙氨酸最大吸收峰在258nm。,茚三酮反应,-氨基酸与水合茚三酮于加热条件下生成一种称为罗曼染料的蓝紫色化合物，同时释出CO2、NH3和R-CHO 。,生成蓝紫色化合物的颜色深浅及释放出CO2多少，均可用于氨基酸的定性及定量测定。,第二节 蛋白质的分子结构,一个氨基酸的-羧基与另个氨基酸的-氨基脱水缩合形成的酰胺键（-CONH）。, 氨基酸在蛋白质分子中的连接方式,肽键(peptide bond),肽（peptide）：氨基酸之间通过肽键连接起来的化合物。,一、蛋白质的一级结构,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由10个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由50个以内的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,读写方向：N C,肽链结构, 生物活性肽 谷胱甘肽(glutathione, GSH),N端,C端,蛋白质的分子结构包括 ： 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),蛋白质的分子结构 The Molecular Structure of Protein,蛋白质分子的结构层次,Lys,Gly,Leu,Val,Ala,His,Amino acids,Lys,Ala,Arg,Met,Glu,Leu,肽键,（三）蛋白质的一级结构 primary structure,定义 蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。,化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶的一级结构,病例：镰型红细胞贫血,蛋白质的空间结构以一级结构为基础。,蛋白质一级结构改变，其空间结构易改变！,蛋白质一级结构影响着蛋白质的生理功能！,镰形红细胞贫血病因,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,多肽链的氨基酸序列分析,测序前的准备 N端分析以确定蛋白质的多肽链数目 断裂二硫键 分离单一多肽链 测定多肽链的氨基酸组成 多肽链氨基末端与羧基末端分析 二硝基氟苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene）法 丹酰氯 (dansyl chloride)法 多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合 对多肽链进行限制性水解成小片段 Edman降解法进行小片段肽段的序列分析 对各片段序列进行比较叠加，拼出完整的多肽序列,蛋白质肽链的局部空间结构，即各段肽链主链原子的空间分布状态，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,定义,化学键：氢键, 蛋白质的二级结构 secondary structure,二、蛋白质的空间结构,肽链结构,主链,侧链,侧链,侧链,侧链,1形成二级结构的基础,肽单元(peptide unit) ：,肽键中的C、O、 N、H四个原子和相邻的两个碳原子处在同一个平面上 。,2.蛋白质二级结构的主要构象,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（1）-螺旋(-helix),氢键,氢键,2019/8/27,47,可编辑,（2）-折叠（-pleated sheet）,氢键,（3）-转角和无规卷曲,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,氢键,核糖核酸酶分子中的二级结构, 蛋白质的三级结构,疏水作用力、离子键、氢键和范德华力等。,化学键,整条肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义,蛋白质的三级结构,稳定和维系蛋白质三级结构的化学键,离子键,离子键,氢键,氢键,疏水作用力,疏水作用力,范德华力,范德华力,二硫键,离子键,氢键,范德华力,疏水作用力,二硫键,结构域（domain）,分子量较大的蛋白质在形成三级结构时，肽链中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生物学功能的特定区域 。,一条肽链的蛋白质必须形成三级结构才有生物学活性！,酶的活性中心,结合基团,活性中心,催化基团,底 物,酶的活性中心是指蛋白质三级结构中的局部二级结构靠近形成的裂缝、缝隙等具有催化功能的区域。, 蛋白质的四级结构,含有两条以上具有独立三级结构的多肽链（亚基）通过非共价键相互连接形成的多聚体结构。,定义,化学键,氢键、离子键、疏水作用力和范德华力等次级键。,血红蛋白的四级结构,（四）蛋白质空间结构的确定 X线晶体分析 核磁共振光谱分析,肌红蛋白结晶的X线衍射图 John Kendrew对抹香鲸肌红蛋白结晶进行了X线衍射分析，其衍射图中包含了25 000个衍射光点。衍射图谱中光点的强度和光点的分布类型提供出蛋白质结构的足够信息。根据这些衍射光点的密度与分布，通过计算机分析，绘出其三维电子密度分布图，进而得出空间结构图形。,蛋白质分子的结构层次,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系,蛋白质特定的构象和功能是由其一级结构所决定的,一级结构主要从两个方面影响蛋白质的功能活性 ：,1、氨基酸残基直接参与构成蛋白质的功能活性区,2、氨基酸残基虽然不直接作为功能基团，但它们在蛋白质的构象中处于关键位置,二、蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质空间构象是其功能学活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。,第 四 节,蛋白质的理化性质及其分离、纯化原理,（一）蛋白质的两性解离,两性电解质 ：,蛋白质分子中既含有能解离出H的酸性基团（如R-C00H、R-SH），又含有能结合H的碱性基团（如R-NH2）,蛋白质的等电点（pI）,溶液处于某一pH值，蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，呈兼性离子，此时溶液的pH值为该蛋白质等电点。,一、蛋白质的理化性质,溶液pH值与蛋白质等电点的关系,电泳,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳.（electrophoresis） 。,Whats electrophoresis?,某蛋白质pI=3.5，电泳缓冲液pH=5.0，通电后该蛋白质向正极还是负极移动？,二、蛋白质的胶体性质,蛋白质是高分子化合物，直径为1100nm。,1、亲水胶体稳定因素：,1）、蛋白质表面的水化膜,2）、电荷的排斥作用,水化膜,蛋白质胶体颗粒的沉淀,（三）、蛋白质的变性与沉淀,1.蛋白质的变性 (denaturation),在某些理化因素作用下，蛋白质的空间构象破坏，导致其理化性质的改变和生物活性的丧失 。,变性的实质：主要是次级键和二硫键的破坏,变性的因素：加热、紫外线、超声波、剧烈震荡；有机溶剂、强酸、强碱、重金属盐、生物碱试剂。,2.蛋白质的沉淀 ：,蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集，从溶液中析出沉淀 。,变性的蛋白质易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定变性（如盐析法沉淀）,盐析 (salt precipitation)：,在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等），破坏蛋白质的胶体稳定性，使蛋白质从水溶液中沉淀 。,盐析法不引起蛋白质变性，只需经透析除去盐分，即可得到较纯的保持原活性的蛋白质。,蛋白质的复性（ renaturation ）,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，仍可恢复原有的构象和功能。,3.蛋白质的凝固作用 （coagulation）,蛋白质变性后结成絮状的不溶解物，再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不再溶于强酸或强碱中 。,蛋白质盐析沉淀,蛋白质凝固,天然状态， 有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（四）蛋白质的光谱吸收与呈色反应,蛋白质分子含有酪氨酸及色氨酸残基 ，具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在280nm。,此特性常用于蛋白质含量的测定 。,蛋白质的呈色反应,双缩脲反应,呈色与蛋白质肽键数目呈正比，不够敏感，定量范围在501000g之间。,蛋白质的肽键与碱性铜发生双缩脲反应，蛋白质中的色氨酸与酪氨酸残基还使磷钨酸和磷钼酸还原生成钼蓝。此法灵敏，可检测出5g的蛋白质。,酚试剂呈色反应（Lowry法）,Bradford显色法,考马斯亮蓝G-250与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色，比酚试剂法灵敏，常用于快速定量分析。,考马斯亮蓝G-250,蛋白质的理化性质与常用的纯化方法,二、蛋白质的提取与纯化原理,（一）改变蛋白质的溶解度,盐析： 高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出。,有机溶剂沉淀： 降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间 相互吸引而沉淀。,离心机,透析(dialysis):,超滤（ultrafiltration）:,凝胶过滤层析,根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。 常用的方法有： 离子交换层析 电泳 等电聚焦,（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法,离子交换层析,离子交换层析分离蛋白质示意图,电泳（electrophoresis）,等电聚焦的阳极用酸性液体，阴极用碱性液体。pH梯度用两性电解质载体（ampholine）制作。,等电聚焦电泳,双向电泳