课件：ALK靶点检测.ppt

ALK靶点及其检测方法,辉瑞肿瘤 赛可瑞 余林,1994年ALK基因异常首次在淋巴瘤中被发现,ALK基因异常首次在间变性大细胞淋巴瘤中被发现 (ALCL), 并因此而得名“ALK” （anaplastic lymphoma kinase）间变性大细胞淋巴瘤激酶 ALK融合到核磷蛋白（NPM）的N-末端部分 (NPM-ALK)导致ALK基因组成性激活。,Science 1994;263:12814 Blood 1997;89:167885,2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因,EML4-ALK,NMP-ALK,Nature 2007;448:5617,2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合类型，并证实为肺癌的驱动基因。并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。,Permanent proliferation & inhibition of apotosis,EML4-ALK fusion protein silenced by crizotinib,Proliferation & survival upon ligand binding to ALK,ALK融合突变在蛋白水平的变化,配体,ALK受体,细胞外,细胞内,正常ALK 信号,细胞外,永久扩增和凋亡抑制,细胞外,克唑替尼抑制 EML4-ALK 融合蛋白,病理性 ALK信号,克唑替尼 作用模式,配体与ALK结合后，扩增和存活,由于与EML4融合，ALK激酶区 异常激活,多效蛋白? 肝素结合细胞因子?,随着ALK靶向抑制剂的发现，ALK基因越来越多的受到重视,2007, Soda & Mano 首次发现EML4-ALK基因,2009, Alice T. Shaw 首次出现EML4-ALK阳性 非小细胞肺癌的称谓，并将其 定义为NSCLC的独特亚型,2010, Kwak EL: 证实克唑替尼治疗有效， 但仍沿用EML4-ALK阳性 非小细胞肺癌的称谓,Soda M, et al. Nature 2007; 448(7153):561-566. Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253. Kwak EL, et al. N Engl J Med 2010; 363:1693-1703.,NSCLC临床病理分型的演变,Current Standard of NSCLC Care,2010 NCCN,NCCN Guidelines, NSCLC, Version 4. 2014 Horn L, et al. Clin Oncol. 2009,驱动基因分型,早期,NSCLC分子分型与治疗决策密切相关,ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？,ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征,Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253.,85.4%的ALK阳性 NSCLC年龄65岁 (PROFILE1007),与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻,ALK阳性患者的中位年龄比EGFR阳性患者中位年龄小15岁,低年龄组ALK阳性率高于EGFR,在低于51岁的人群中，ALK阳性率高于EGFR阳性率，可达18.5%，所以对于年轻患者来说，在标本限制的情况下建议先检测ALK靶点。,Scientific Reports; Li Zhang,2014,中国ALK突变的发生率有多高？,早期患者（手术标本）ALK阳性率4.5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。,不同人种中克唑替尼的疗效的差异,Fei-Yu Niu, Yi-Long Wu. Onco Targets and Therapy 2 May 2015,亚裔或者中国患者，ORR维持在70%以上；克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.6个月,什么样的人群需要进行ALK检测？,非小细胞肺癌靶向个体化诊疗策略更新要点,P71,P69,腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测,少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测,为了识别出已经有有效药物治疗的罕见驱动基因靶点，NCC指南强烈推荐对肿瘤病人进行更广谱的肿瘤驱动基因检测，或为病人推荐可获得的临床研究。广谱的驱动基因筛查是改善NSCLC预后的关键,Version 4.2016,强调分子检测的重要性,如何检测ALK融合突变？,CFDA获批的三种诊断方法,ALK break-apart FISH assay (Abbott Molecular, Vysis probes),ALK immunohistochemistry (Roche Ventana),Split,Isolated red,Amoy Dx EML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCR （厦门艾德）,荧光原位杂交（FISH）,阳性（分离 倒位）,2p23-21,5,ALK,EML4,3,倒位（70）,基因融合,阴性 两个信号之间的距离 小于2个信号直径, 12 Mb,本图由Lukas Bubendorf提供,实时逆转录法（RT-PCR）原理,20,Ventana IHC 试剂设计,ALK融合蛋白: 无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白 部分ALK融合蛋白表达较低 Ventana IHC的原理: 使用具有高度敏感性和特异性的一抗D5F3 全自动仪操作，充分保证特异性 独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性,D5F3 rabbitt monoclonal antibody,Optiview DAB IHC Detection,Optiview Amplification Kit,0,1+,2+,3+,Neg,Pos,Pos,Pos,CST-IHC,Ventana-IHC,Pos,Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性 -创建一个“二元”的判读系统,J.Ying,et al. Annals of Oncology 2013;,Ventana IHC与FISH检测结果比较,(1)Jinghui Wang,et al. PLoS ONE 2014 9(7): e101551 (2) Eugen C. Minca,et al. J Mol Diagn 2013, 15: 341-346 (3) Murry W. Wynes,et al. J Thorac Oncol. 2014;9: 631638 (4) Greta,et al. Arch Pathol Lab Med. doi: 10.5858/arpa.2013-0388-OA （5）J.Ying;et al. Annals of oncology.2013,24:2589-2593,全自动Ventana IHC优势一,判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读 IHC 阳性 = FISH 阳性,全自动Ventana IHC优势二,全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好,全自动Ventana IHC优势三,价格便宜，可同时用于ALK的筛选和诊断,EMEA（欧盟）、CFDA批准Ventana IHC用于诊断ALK阳性NSCLC，从而帮助确定可使用克唑替尼的患者,Ventana IHC试剂盒已于2013.8全部获得CFDA批准，用于检测A