课件：化疗联合靶向治疗.ppt

Sunitinib与奥沙利铂联用对人肠癌 Lovo细胞的作用,研究背景,大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年大约有接近一百万新发病例,同时至少五十万患者死亡 。,20年前, 5-Fu是唯一的治疗晚期大肠癌有效的药物,其中位生存期只有12个月左右。近10年来,草酸铂、伊立替康、卡培他滨等新的细胞毒药物相继问世,将中位生存期提高至20个月左右。,传统的化疗缺乏特异性，而靶向治疗单药有效率低，因此，如何将化疗与靶向治疗有机结合成为肿瘤治疗的研究重点。,分子靶向治疗常用的治疗靶点有： 细胞受体 信号传导 抗血管生成等,血管生成在肿瘤的生长、侵袭、转移和演进中起着非常重要的作用,血管前期 弥散作用 生长缓慢 实体瘤 血管期 新生毛细血管 生长迅速,研究背景 Sunitinib,Sunitinib是一种小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂, ,对血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、干细胞因子受体(C-Kit)等多种受体酪氨酸激酶具有抑制作用。,图1 Sunitinib抗肿瘤作用机制,Sunitinib单药临床有效率低,如何与化疗联合提高抗癌效应备受关注。,研究背景 奥沙利铂,奥沙利铂(Oxaliplatin)是一种水溶性的铂类复合物,对肿瘤细胞有细胞毒作用,具有抗肿瘤活性是由于铂化后链间和链内形成加合物致DNA合成抑制,抗肿瘤活性不受DNA错配修复缺陷或复制旁路强化的影响,与顺铂和卡铂无交叉耐药。,研究内容,根据细胞生长曲线及单药作用抑制率设计实验方案,先奥沙利铂+sunitinib24 h后sunitinib48h,先奥沙利铂24 h后sunitinib 72 h,化疗药物联合舒尼替尼,作用于肿瘤细胞系,先sunitinib 72 h后奥沙利铂24 h,实验方法 材料,细胞株： 大肠癌Lovo细胞 主要试剂及试剂盒： 注射用奥沙利铂（Oxaliplatin） 苹果酸舒尼替尼（Sunitinib/Sutent） Hoechst凋亡试剂盒 细胞周期及凋亡检测试剂盒,实验方法 材料,主要仪器设备： 流式细胞仪 酶标仪 荧光显微镜,实验流程,结肠癌 Lovo细胞,舒尼替尼,细胞学实验,细胞增殖与活力检测,化疗药物（奥沙利铂）,周期及凋亡检测,Annexin V 联合PI法,MTT法,Hoechst法,选定几种最佳的药物联合治疗方案,实验方法 主要试剂配制,逐次稀释苹果酸舒尼替尼、奥沙利铂，使之成系列浓度。,实验方法 MTT法检测细胞增殖情况,单药处理： 培养细胞 铺板 加化疗药 加DMSO 弃液 加MTT 震荡 酶标仪测值 数据处理,实验方法 MTT法检测细胞增殖情况,双药处理： 培养细胞 铺板 加抑制剂 加DMSO 加MTT 加化疗药 震荡 酶标仪测值 数据处理,实验方法 Hoechst法证实细胞凋亡存在,正常细胞对染料拒染，荧光着色淡 凋亡细胞主要摄取Hoechst染料呈强蓝色荧光 处于亚二倍体区的细胞群属于形成凋亡小体的 细胞,实验方法 Hoechst法证实细胞凋亡存在,培养细胞 药物干预 单细胞悬液 染 色 洗 涤 固 定 洗 涤 铺 片 检 测,实验方法 AnnexinVPI法检测凋亡,培养细胞 药物干预 单细胞悬液 孵育 加试剂 分装 流式细胞仪分析,2019/9/1,23,可编辑,实验结果 不同时间抑制率比较,图2 药物Sunitinib在不同时间对Lovo细胞的抑制（%）,注：方差齐性检验P= 0.1904,经分析结果显示, 处理组间变异F=14.28，P=0.0012，可以认为不同用药时间抑制率值的差异具有统计学意义；三组之间的两两比较采用SNK-q检验，三组间差异均具有统计学意义；区组间变异F=5.92，P=0.0301，可以认为不同用药浓度抑制率值的差异具有统计学意义。,Sunitinib作用于Lovo细胞表现出明显的时间、浓度依赖性,实验结果 不同时间抑制率比较,图3 药物奥沙利铂在不同时间对Lovo细胞的抑制（%）,注：方差齐性检验P= 0.1904,经分析结果显示, 处理组间变异F=8.34，P=0.0913，尚不能认为不同用药时间抑制率值的差异具有统计学意义；区组间变异F=4653.40，P0.0001，可以认为不同用药浓度抑制率值的差异具有统计学意义。,奥沙利铂的时间依赖性效应相对不明显，存在浓度依赖性,实验结果 不同时间抑制率比较,注： A奥沙利铂 B Sunitinib 图4 不同方案在各测量时间对Lovo细胞的抑制（%）,注：方差齐性检验P= 0.1904,经分析结果显示, 处理组间变异F=35.07，P0.0001，可以认为不同给药方案抑制率值的差异具有统计学意义；五组之间的两两比较采用SNK-q检验，五组间差异均具有统计学意义；区组间变异F=32.71，P0.0001，可以认为不同用药浓度抑制率值的差异具有统计学意义。,实验结果 细胞周期,肠癌Lovo 细胞经奥沙利铂作用24h再经Sunitinib作用72h后，G0/ G1 期细胞由61.18%2.27%下降到6.58%2.16%,S 期细胞由29.35%1.23%下降到28.47%1.83%,而G2/ M 期细胞由11.79%2.08%上升到66.84%2.44%。由此可见，先奥沙利铂后Sunitinib联合方案能将更多的细胞阻滞在G2/M期。,实验结果 细胞凋亡,肠癌Lovo 细胞经奥沙利铂作用24h再经Sunitinib作用72h后，早期凋亡率为13.28%1.64%，晚期调往率为8.77%2.52%，总凋亡率为20.85%2.32%。,Hoechst法结果 图5 对照组Lovo细胞的荧光显像（100）,图6 最佳方案处理组Lovo细胞的荧光显像（200） （先奥沙利铂24h后Sunitinib72h组）,讨 论,Sunitinib与奥沙利铂联用作用于人肠癌Lovo细胞存在最佳联合模式,其可将可将细胞阻滞在G2/M期，存在显著凋亡。,讨 论,提示:已知化疗药物诱导细胞损伤后，部分细胞在G2/M期开始DNA修复和分裂，从而逃避凋亡。奥沙利铂后给予Sunitinib可将细胞阻滞在G2/M期，进一步干扰损伤细胞的修复，维持奥沙利铂诱导的凋亡。,讨 论,提示：奥沙利铂引起的细胞损伤后,肿瘤细胞为逃避死亡，可能激活信号传导通路,在这种情况下，Sunitinib阻断通路,联合细胞毒作用，可诱导肿瘤细胞的凋亡，并造成肿瘤细胞的不可修复性损害。,结 论,本研究着眼于Sunitinib与化疗药物联合方案的临床合理应用，旨在为Sunitinib用于肠癌治疗提供联合用药的实验依据。具体研究结论可归纳为以下两点： 1、Sunitinib与奥沙利铂联合的体外抗肿瘤作用存 在方案依赖性。 2、先奥沙利铂后Sunitinib序贯方案具有较强的抗 肿瘤效应，其机理可能与抑制化疗后肿瘤细胞 的损