课件：新冠状病毒的实验室检测.ppt

人冠状病毒病原学与实验室检测,谭文杰 中国疾控中心病毒病所 病毒病应急技术中心,20120929,冠状病毒（coronavirus) 概述： 1933年，Baudette等描述了鸡的“哮喘病”，1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒，分离的病毒被鉴定为传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis,IBV); 1951 年，Gledhill等分离出鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus,MHV)； 1965年，Tyrrell和 Bynoe首次在体外用人胎鼻和气管培养方法，从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。,1966年， Hamre 和Procknow用人胚肾细胞分离到类似病毒，代表株命名为229E病毒。 1967年，Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43（OC代表 organ culture）。随后证明，OC和229E病毒。 1968年， June Almeida和Tyrrell对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。 1975年，国际病毒命名委员会（International Committee on the Taxonomy of Viruses,ICTV）正式命名了冠状病毒科（coronaviride) 致病性：人冠状病毒常引起 1)普通感冒、是轻型感染。 2)腹泻或胃肠炎。3）下呼吸道感染或肺炎,HCoV 基因组与mRNA,HCoVs为最大单股正链RNA病毒，独特的胞浆内非连续性转录模式，易于发生基因组的变异与重组,SARS-CoV,中国大陆 全中国 全世界 发病 5327 发病 7429 发病 8096 死亡 349 死亡 685 死亡 774,涉及世界29个国家和地区,2002年冬2003年春始发于我国广东，而后蔓延至我国大部分省市，并波及世界29个国家和地区。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，严重急性呼吸综合症是由一种从未引起人类疾病的新型冠状病毒所致，这种新的病毒被命名为SARS-Coronavirus (SARS-CoV),SARS (severe acute respiratory syndrome) 严重急性呼吸综合征21世纪新出现的传染病,在SARS-CoV发现后，又有三种新的引起呼吸系统疾病的HCoV（HCoV-NL63，HCoV-HKU1与HCoV-2012）被相继发现，引起人类呼吸道疾病的HCoV （包括SARS-CoV）已有6种，急需研发这类疾病诊断和鉴别诊断的新技术。,继SARS-CoV后,新HCoV病原的发现,HCoV-2012,冠状病毒 NL63 van der Hoek et al., 2004. Nat. Med. 10:368-373,最初从一名七月龄的，因发烧、细支气管炎和结膜炎入院的患儿中分离。 在Hela和TMK细胞中检测到细胞毒效应CPE。 随机扩增，分离出特异性片段，经测序证明是一种新的呼吸道病毒。 NL63的特异性RT-PCR检测儿童的 NPA为阳性。 回顾性的分析从2002年12月到2003年2月中测序的呼吸道样本中，有7例阳性标本。 其中五个患儿是4-6月龄，两个患者,分别是40岁和67岁。,冠状病毒 HKU1 Woo et al., 2005. J. Virol. 79:884-895,从一名71岁的患有肺炎的老人中分离出来。 该患者吸烟，并患有慢性阻塞性肺病。 临床症状：发烧，咳嗽，脓性痰，胸肺X光片显示有斑点浸润。 常规病毒学检测呈阴性。 RT-PCR 确定是一种新的冠状病毒。 回顾性筛选400份NPA样本，有一例是阳性，患者是一名35岁的妇女，患有肺炎。 定量 RT-PCR： 1.1 x 106 copies/mL,北京儿童医院重症下呼吸道感染婴幼儿呼吸道病毒的检测,2008-2010年，采集住院病人鼻咽拭子370份，应用xTAG RVP Panel 试剂盒进行多种呼吸道病毒检测。 样品检出阳性率：96.22% 检测结果表明，感染率较高的病毒分别为： Piconavirus：54.05% RSVB： 46.49% Bocavirus： 33.78% PIV3: 15.41% Adenovirus： 12.97% HMPV： 8.65% IFVA： 7.03% HCoVs： 6.76%,xTAG Respiratory Viral Panel Version1 (RVP呼吸道病毒检测试剂盒)产品基于Luminex开放式结构平台，将xTAG 技术与xMAP 技术有效融为一体，可快速准确检测多种呼吸道病毒。已或美国FDA 批准临床应用,发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律,2012中东出现的新型冠状病毒,近日，一名曾前往沙特旅游的卡塔尔男子被确认感染了一种新型冠状病毒，也一度被媒体称为类似SARS病毒。目前这名男子正在英国接受治疗，生命垂危。 其肺部组织提取的病毒与此前沙特曾出现的一个死亡病例相比，基因排序相似度为99.5%。 两人的临床表现都是急性重症呼吸道感染合并急性肾衰竭。 目前在全球只确认了这两个病例。还没有证据表明该病毒能够在人与人之间进行传播。 新的冠状病毒和引起非典(严重急性呼吸系统综合征)的冠状病毒不同。,Fig. Phylogenetic analysis based on 1a gene of coronaviruses and the new novel coronavirus,基于已知序列的系统发生分析,2,1,3,London1与Bat-CoV-HKU5序列比对,比对结果显示，London1与HKU5的相似性83.2%,London1与Bat-CoV-HKU4序列比对,比对结果显示，London1与HKU4的相似性82.7%,Examples of bats and birds from which novel coronaviruses were discovered.,Chinese horseshoe bat (Rhinolophus sinicus) (panel A), from which bat-SARS-CoV and bat-CoV HKU2 were discovered; Lesser bamboo bat (Tylonycteris pachypus) (panel B), from which bat-CoV HKU4 was discovered; Leschenaults rousette (Rousettus lechenaulti) (panel C), from which bat-CoV HKU9 was discovered;,A model of coronavirus evolution,CoVs in bats are the hypothesized gene pool of group 1 and group 2 CoVs and CoVs in birds are the hypothesized gene pool of group 3 CoVs.,急性呼吸道感染诊断,临床诊断 非特异性实验室检测 X-光检测 特异性实验室检测 呼吸道及血清样本用来: 抗原检测 病毒分离 核酸扩增,病毒分离: 金标准 抗原检测: 迅速，敏感,血清学抗体检测：IgM检测; IgG检测:需要两个样本 中和试验 核酸检测： 快速敏感,病毒诊断学,2019/9/3,21,可编辑,潜伏期 1-12 天,平均 5-6 天,潜伏期内无传染性, 发病 即有传染性 若将一个传染周期定在 5-6 天(平均潜伏期), 发病 5 天内能确诊病人, 则可能将疫情有效控制在 2 代病人以内,BSL-3,1SARS诊断分类与标准 （1）疑似病例：对于缺乏明确流行病学依据，但具备其它SARS支持证据者，如临床表现和肺X线变化等，可以作为疑似病例，需进一步进行流行病学追访，并安排病原及血清学检查以求印证。对于有流行病学依据，有临床症状，但尚无肺部X线影像学变化者，也应作为疑似病例。 （2）临床诊断病例：对于有SARS流行病学依据、相应临床表现和肺部X线影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出SARS临床诊断。 （3）确定诊断：在疑似和临床诊断的基础上，若分泌物或血清SARS-CoV RNA检测阳性，或血清（或血浆）SARS-CoV特异性N蛋白抗原检测阳性，或血清SARS-CoV抗体阳转，或抗体滴度4倍及以上增高，则可做出确定诊断。,呼吸道样本,拭子或抽吸物 鼻咽拭子 气管、支气管深部灌洗，肺泡灌洗液 样本转移液,SARS实验室检测方法一览表,SARS网络实验室检测内容与方法建议,建议对不明原因重症肺炎常规进行血清SARS-CoV N蛋白检测,HCoV（2012） 实验室检测,近期曾往中东地区，出现上呼吸道感染后，如果症状加重，或呼吸困难，建议立刻就诊并进行实验室检测。 WHO发布了临时病例定义来帮助各国加强针对这种新病毒的健康保护措施。基于目前发现的病例，分为“正在调查中的病人”、“可能病例”和“确诊病例”。病例的分类基于临床、流行病学和实验室检测指标。 目前可进行分子检测（PCR与荧光定量PCR）,London1_novel_CoV_2012_nsp12(partial),TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATCAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT (208 nt),partial nucleotide sequence of the viral polymerase (nsp12),系统发生分析,HPA公布的结果，2012-9-25,GenBank BLAST 比对结果,1.,2.,London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列与与SARS-CoV-Tor2 株相应区段同源性为73.6%,引物设计与应用,基于上述引物探针，我们已建立常规PCR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1; nested PCR: F-1,R-2； PCR片段127bp) 两种荧光定量PCR方法（ F-1,R-2，TZ1；或 F-2,R-2，TZ2) 与其他人冠状病毒无交叉反应；可初步用于新型冠状病毒（2012）的实验室检测。,引物设计与应用2,基于对London-1 Novel Coronavirus 已知序列与Bat-CoV-HKU多株序列比对，我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分别用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特异性检测。,核酸(基因)检测,冠状病毒检测通用引物对: Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-RV (5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3),冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳,One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit; QIAGEN) a 50 l reaction volume containing 10 L RNA-extract, 10 l 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 2 l dNTP mix (final concentration of 400 M of each dNTP), 1.8 l QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix (a combination of Omniscript and Sensiscript reverse transcriptase and Hot-StarTaq DNA polymerase), 4 M of each primer, and RNase-free water to 50 l. The reaction was carried out with an initial reverse transcription step at 50C for 30 min, followed by PCR activation at 95C for 15 min, 50 cycles of amplification (30 sec at 94C; 30 sec at 48C; 1min at 72C), and a final extension step at 72C for 10 min,定量 PCR，TaqMan体系,ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) 。 实时检测: 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质,定量RT- PCR检测,试剂盒：Real-Time One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems). 25-L 反应体系含：12.5 L of 2X Master Mix, 0.625 L of the 40X MultiScribe and RNase Inhibitor mix, 0.25 L of 10 M probe, 0.25 L each of 50 M forward and reverse primers, 6.12