课件：原发性肝癌的基因治疗.ppt

基因治疗,原发性肝癌（）是全球第 三大肿瘤相关死因。随着分子生物学及相关学科的发展， 的基因治疗已成为继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的 第种治疗模式。自杀基因以其高度特异性的负选择标记， 杀伤多种耐药性肿瘤细胞等优势成为肝癌基因治疗的重要组成部分。,1、自杀基因 2、反义RNA技术 治疗 3、免疫基因治疗 方法 4、抑癌基因治疗 5、RNA干扰技术 6、联合基因治疗法,The strategies of gene therapy for liver cancer,1、 自杀基因治疗,1、定义：某些病毒、细菌等原核生物含有一类基因，其编码的酶能将原来无毒的药物前体转化为具有细胞毒性 的代谢物而杀伤宿主细胞，这类基因称为“自杀基因”。 我们可以将自杀基因导入体内后， 利 用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而特异性杀死肿瘤细胞。目前常用针对肝癌基因治疗的有单纯 病毒型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系(HSV-TK/GCV) 和胞嘧 啶脱氨酶/5 氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系统。,Won 等 通过单纯疱疹病毒将 AFP 反转剪接靶 RNA 构成酶导入肝癌细胞，取代 HCC (肝癌细胞)高效表达 AFP 的 RNA 残基， 结果明显延缓肿瘤细胞生长并降低了细胞中表达 AFP 的 RNA 水平。 2、应用在肝癌基因治疗研究中应用最多的自杀基因是TK(胸腺嘧啶脱氧核苷酸酶)基因和CD(胞嘧啶脱氨酶)基因。,HSV-TK（来源于单纯疱疹病毒HSV）将无毒性的抗病毒药如gancidovir(GCV)或acidovir(ACV)生成细胞毒的磷酸化合物，可抑制DNA聚合酶和终止DNA的合成，能特异性杀伤分裂期肿瘤细胞。 VZV-TK（来源于水痘-带状疱疹病毒VZV）则可将6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷转变为毒性产物6-甲基嘌呤阿拉伯糖三磷酸核苷，从而选择性杀伤表达VZV-TK的细胞。 CD是一种发现于细菌和真菌的酶类，真核细胞中缺乏此酶。它可使胞嘧啶和5-氟胞嘧啶(5FC)分别生成尿嘧啶和5-氟尿嘧啶(5-FU)。氟尿嘧啶(5-Fu)则是常用的抗肿瘤药物。通过基因转移和使用组织特异性启动子的方法使CD基因仅在肝癌细胞中表达，继以氟尿嘧啶(5-Fu)治疗，能特异性杀伤肝癌细胞，正常细胞则不受影响。,设计策略,构建携带自杀基因的重组病毒载体 目的基因的转导（体外） 使用一定的方法检测转导效率,转导自杀基因后继以GCV、ACV或氟尿嘧啶(5-Fu)等药物治疗，观察肝癌细胞株或肿块的生长情况、形态变化等,具体过程：,A.构建携带自杀基因的重组病毒载体 常用于肝癌自杀治疗的病毒载体有两类：反转录病毒和腺病毒，它们一般是复制缺陷型病毒。 反转录病毒只感染分裂期癌细胞，其基因组整合入宿主染色体中，但滴度低，转染效率不高，且可能产生有复制能力的病毒，存在潜在的致癌危险。 腺病毒可感染非分裂细胞，其滴度和感染效率均较高，感染时不整合到宿主染色体中，故没有致癌的潜在危险。,C.使用一定的方法检测转导效率，如用ELISA法检测酶活性，PCR法测基因表达产物，免疫组化法计数转导细胞等。 B.目的基因的转导，活体外通过将病毒与肝癌细胞株共同培养获得，在活体内则是在注入癌细胞建立动物模型后，再直接在肿块内注射相应的病毒载体。 D.转导自杀基因后继以GCV、ACV或氟尿嘧啶(5-Fu)等药物治疗，观察肝癌细胞株或肿块的生长情况、形态变化等。,自杀基因治疗的“旁观者效应”：,当将转导了自杀基因的肿瘤细胞与其未转导的父系细胞共同培养时，不仅转导细胞被杀死，相邻的未转导细胞也可被杀死。体外培养的转导细胞仅占细胞总数的10%时，便可观察到明显的旁观者效应，在活体内有同样类似效应。该效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用，在相当程度上弥补了转导效率低的问题，对恶性肿瘤的治疗有着十分重要的意义。,评价：,肝癌自杀基因治疗的研究取得了不少令人瞩目的进展，展示了肝癌治疗新的希望。 问题：1、 目的基因在体内的持续稳定表达和有效调控，病毒载体安全性和靶向性的统一。2、AFP（血清甲胎蛋白）启动子/增强子有助于特异性杀伤肝癌细胞，但并非所有肝癌患者AFP水平都增高，如何使自杀基因高度选择性地表达于肝癌细胞而又不影响非肝癌细胞，也是有待解决的问题之一。 目前的研究仍停留在动物实验阶段，尚未见临床应用的报道，从动物实验过渡到临床尚需要相当一段时间。,2、反义RNA技术,定义：反义RNA技术是利用反义分子针对性的设计与异常激活的癌基因及其mRNA互补的反义封条，特异性封闭这类基因，使之失活、不表达或低表达。,作用机制：,A. 互补于特定的mRNA起始密码上游的SD序列和/或编码 区，直接抑制翻译或使靶mRNA易被核酸酶降解。 B.互补于特定的mRNA非编码区，如SD序列的上游区，干 扰核糖体结合，间接抑制翻译。 C.阻抑特定的基因转录，如作用于mRNA5端编码区的起始 密码子AUG，阻断完整的RNA转录。,D.作用于mRNA5端，阻止帽子结构形成。 E.作用于外显子和内含子连接区，阻止前mRNA剪接。 F.作用于polyA尾部，阻止靶mRNA的成熟及胞浆转运,设计策略：,反义RNA表达载体的构建,反义RNA的体外微注射,脂质体携带反义RNA,核酶嵌合反义RNA,诱导细胞内反义RNA的产生,具体方法：,A. 反义RNA表达载体的构建： 利用基因重组技术，在适宜的启动子与 终止密码子之间反向插入一段靶基因，构建人工反义RNA表达载体后再转化入致瘤的细胞内，反义RNA就能抑制或消除细胞内源性靶基因所编码mRNA表达，使致瘤细胞丧失致瘤性。 例如将反义IGF-1受体基因的表达载体转入肝转移癌细胞株中，可抑制癌细胞生长，提示反义基因具有下调被转化细胞恶性表型的作用。,B. 反义RNA的体外微注射： 利用纯制的噬菌体RNA聚合酶来产生反义RNA再通过微注射入细胞中。该疗法主要的优点是被转入细胞能提供反义RNA合适的细胞环境，无需启动子或载体，亦不存在细胞摄入障碍或降解、取代等问题。,C.脂质体携带反义RNA： 可用于体内、外系统，目前最有希望的三种制剂：抗体-定向脂质体，阳离子脂质体，中性脂质体，如将人工合成的反义寡核苷酸与亲脂嵌合剂或载入脂质体相连接，既可增加穿透细胞膜的能力，提高归巢性，亦可通过嵌入碱基对之间提高反义RNA的稳定性和生物功能。,D.核酶嵌合反义RNA： Ribozyme能在某些特异的碱基序列GUC或CUC位点裂解与其杂交的RNA分子。因此将Ribozyme编码基因插入反义RNA表达载体的适当位置，其转录产生的含Ribozyme的反义RNA能与靶mRNA结合，在GUC或CUC裂解，达到反义抑制或裂解靶mRNA的双重功能，从而加强对靶细胞表达的抑制效果。,E.诱导细胞内反义RNA的产生： 目前反义范畴主要集中在外源性反义核酸或人工表达的反义RNA方面，然而肿瘤则是一种多基因参与、存在复杂调节机制的分子病。因此，只有天然的反义RNA调控作用才有更大的价值。因此通过特异的基因调控药物来诱导内源性反义RNA的生成，可避免外源性反义RNA可能因化学修饰或遗传干扰所产生的毒性。 国外现已发现一种细胞内活性酶称为“dsRNA解链酶或变性酶”，能修饰或改变双链RNA结构，受看家基因(housekeepinggene)所调控，目前国内外学者正致力于天然存在的反义RNA调节机制的研究。,2019/9/3,23,可编辑,反义技术在肝癌治疗中的作用:,癌基因反义封条 抑癌基因反义封闭 自分泌生长因子和/或受体反义技术,存在问题：,A.肝癌的发生涉及多基因或累积性基因损伤的过程，单个癌基因激活不足形成肝细胞癌变，因此，仅仅设计单一癌基因的反义RNA则不能完全阻断或抑制肝癌细胞生长。 B.体内特异性靶向运转问题，既是反义治疗有效的基础，也是尚在探索的问题，关键在解决好mRNA二级结构的相互反应性，避免错配误差。 C.尽管在反义设计中可采用化学修饰的方法来降低反义寡核苷酸对核酸酶消化的敏感性，但立体选择性的设计仍有难度，目前亦不能克服反义寡聚物在体内迅速失活的问题。,D.反义投送载体实用化的问题，是反义治疗的难点之一，虽然目前采用的质粒或逆病毒载体经过遗传改变，但细胞产生所需要的蛋白难以进入血液系统或随着时间减少，难以持久稳定性表达，同时还存在宿主细胞免疫系统产生的排斥反应。 E.治疗安全性及价格昂贵：由于寡核苷酸是化学合成药物，通过对天然产物的修饰而成，可能会产生化学毒性。目前如Sigma，Syntyecell等提供20聚体的反义药物每克价格达400010000美金不等。,应用：抗血管生成基因治疗（反义 VEGF 法）,恶性肿 瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，为了不断地获得氧和养料，肿瘤细胞就要不断的分泌促血管形成 因子，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，因此，抑制肿瘤血管形成可以导致肝癌细胞衰退。肿瘤血 管生成中最主要的是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。有试验表明 ，用脂质体法转然反义 RNA 对抗血管内 皮生长因子，能够抑制裸鼠的种植性肝癌的生长。,人类肿瘤的持续生长要依赖于血管增生，有3个证据可说明 VEGF 在肿瘤血管增生中发挥着中心作用。第一，在许多实体瘤坏死区周围的栅栏细胞内可检测到 VEGF 的高水平表达，当这些肿瘤细胞生长 在 缺 氧 状 态 时，会 迅 速 诱 导 VEGF 表 达。这事 实 可 把 肿 瘤 细 胞 表 达 VEGF 和 促 进 它 表 达VEGF 的生理刺激（缺氧）联系起来。同时在肿瘤血管上皮内可测到 VEGF 的两个受体表达均增高，提示 VEGF 对肿瘤内皮细胞的生长有重要影响；第二，注射 VEGF 抗体能明显减慢接种肿瘤细胞在体内的生长，此肿瘤细胞能产生较强的血管增生，第三，通过逆转录病毒转染 VEGF-R2 阴性突变株入肿瘤内皮细胞会明显减少肿瘤的大小。总之，这些证据足以说明 VEGF 和其受体在肿瘤的血管发育中发挥着重要作用，并且可通过干扰旁分泌环路对肿瘤进行治疗。,应用人工合成的寡聚脱氧核苷酸（oIigodeoxnu CIeotides，即 ODN），一般含 15 20 个碱基，以胞吞方式进入细胞，根据碱基互补原则与靶 mRNA 结合发挥封闭作用。结果是 VEGF 蛋白分泌减少，肿瘤组织血管生成受抑制。 其作用机制主要为：反义 ODN 互补作用于内含子和外显子的连接区域，干扰 hnRNA的剪切和外显子的拼接；反义 ODN 与 mRNA 配对形成杂交双链，成为 RNase 的作用底物，由 RNase 水解杂交双链中的RNA 链，从而阻断 特 定 基 因 的 表达。ODN 最佳作用部位为翻译起始区，因为该部位重要且易形成互补双链。,评价：,反义 VEGF 主要是针对肝癌生长和转移起重要作用的血管内皮细胞。它具有以下优势：1、低毒性或无毒性；2、不需要药物进入肿瘤细胞；3、不可依赖于肿瘤的生长分数，肿瘤细胞的异型性甚至类型而控制肿瘤生长；4、由于血管内皮细胞属于正常细胞，可以不考虑突变问题。 缺陷：1、尽管反义VEGF 可明显阻止早期肿瘤的生长，但对晚期肿瘤生长几乎没有影 响。因 为 晚 期 肿 瘤 可 产 生FGF(成纤维生长因子)、TGF或其它血管生成因子，足 以 弥 补 VEGF 的 损失。,2、肿瘤细胞可分泌许多细胞因子，如前列腺素、TNF、FGF 等，这些因子可上调其他非肿瘤细胞的 VEGF 表达； 3、在载体方面，目前常用的腺病毒载体不能外源性传递给体内的每一个肿瘤细胞，这或许是目前不能完全达到抗癌效应的一个重要因素。 4、在反义分子的序列设计上，由于不能完全认识 mRNA 的空间结构，就会影响反义分子在体内特异性运送到靶部位，从而降低抑制效果。,反义VEGF 治 疗 肝 癌 目 前 还 没 有 正 式 进 入 临床，但方法设计简单，新颖，作用强，且特异性高，极有可能成为治疗肝癌的一种良好选择。,3、免疫基因治疗,免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。 目前有基因疫苗（DNA疫苗）、 免疫治疗、免疫刺激性因子免疫治疗、共刺激分子免疫治疗、活化的淋巴细胞进行过继免疫治疗、DC 为基 础的免疫治疗。,4、抑癌基因治疗,在所有的抑癌基因中 p53 基因的突变率较高，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处 于持续分裂状态而增加突变及转化的概率。通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌 基因的功能，从而抑制肿瘤的生长和转移，常用野生型 p53、p16 等。,5、 RNA 干扰技术的应用,RNA 干扰(RNA interference， RNAi)技术， 也称为基因沉寂疗法， 是利用双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA)诱发对宿主细胞特异性 RNA 转录的抑制，从而抑制特异的基因表达的方法。利用 RNAi 技术可同时阻 断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。,6、联合基因治疗,不同的肝癌基因疗法是根据肝癌发病原因、发病过程的各个阶段及肝癌的特殊生物学特性设计的，杀伤的机制和作用途径各不相同，因此不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，增强抗肿瘤效果。 常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗，在肝癌联合基因治疗试验中，将自杀基因与免疫基因治疗联合应用，在增强机体抗肿瘤免疫能力同时直接杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤、防止转移及复发的目的。,实例：,Anna等通过免疫基因IL-2和HSKTK基因联合应用治疗鼠肝癌模型，疗效明显好于单一基因治疗。Kim等联合应用自杀基因CD5FC和免疫基因IL18转染人肝癌细胞株，短期内肝肿瘤体积即明显缩小，