生物性检材的个人识别课件

,法 医 学,第十三章 生物性检材的个人识别,编者 张霁（四川大学）,第一节 概述,什么是个人识别？ 如何进行个人识别？ 什么是遗传分型？ 什么是遗传标记？ 如何进行DNA分型？ 如何解释DNA证据？ 个人识别的意义？,个人识别,分析生物性检材以揭示个体身份的鉴定工作,什么是遗传分型?,所谓分型，是指通过一定的技术手段确定个体特定遗传标记的表型或基因型。,法医遗传标记分类,DNA分型,DNA遗传标记有足够的多态性，理论上可以通过DNA分型，而不必通过测定全基因组序列来进行个人识别 DNA分型能从任何含有细胞的体液或组织中得到相同的结果 能够对陈旧斑痕 极微量的检材分型 分析结果能构成计算机数据库 快速分型的能力，可以尽快排除无辜的犯罪嫌疑人，使鉴定工作不至于延误案件调查。,生物性检材的特点,环境、保存条件所产生的影响和某些不确定性！,分析生物性检材的策略,观察形态学特征 进行化学、免疫学、生物化学与分子生物学实验检测 由简单到复杂，逐步排除，逐步缩小范围的实验分析策略减少不确定性，实现个人识别。,检材的发现、采集、包装和送检,要点提示： 提取物证检材的基本原则 如何保存液体或湿润的生物检材 为什么检材不能用福尔马林固定 塑料袋装生物检材有何不妥 物证检材提取、包装、送检 主要注意事项,检材的发现、采集、包装和送检 检材的发现,散在分布; 对不明显的生物性检材，需要针对生物性检材各自不同的特点和理化性质，利用不同的理化手段，努力去寻找发现。 例如：血痕：鲁米诺喷雾荧光 精斑：紫外线照射银白带暗紫晕荧光,检材的发现、采集、包装和送检 检材的收集,确保证据链的有效性： 翻动现场物件或提取生物性检材前，先拍照、绘图、测量和记录其原始状态，切勿破坏原有生物性检材或添加无关痕迹或物品。 提取生物性检材的方法根据物品种类而异。 可参照中华人民共和国公共安全行业标准法医学物证检材的提取、保存与送检 GA/T 1691997。,检材的发现、采集、包装和送检 检材的包装和送检,尽快送检； 不能用福尔马林固定； 福尔马林会导致DNA降解、DNA分子与其它生物分子之间的交联，影响DNA分析。 低温保存或晾干保存； 纸袋包装。,生物性检材的检验程序和要求,为确保证据链的有效性及合法性，从检材受理到最终的检验报告，都需要严格遵循法医生物性检材检验的一般程序进行。,第二节 血痕检验,要点提示： 血痕检验的目的 血痕检验的一般程序 血痕预实验的目的、方法和意义 血痕确证实验的目的、方法和意义 种属鉴定的方法和原理 血痕的个人识别,血痕检验的目的,送检检材是否是血； 是人血还是动物血； 测定遗传标记进行个人识别； 其它检验，如出血量、出血时间、及出血部位推断等。,血痕检验的一般程序,肉眼检查； 预试验； 确证试验； 种属鉴定； 遗传标记测定及性别鉴定； 出血部位、出血量、血痕陈旧度等推断。,血痕的肉眼检查,血痕的数量、分布、位置、大小、形状、范围、色泽、它们的相互关系以及它们与现场其它物品的相互关系。 作用： 案件性质分析； 现场重建等,血痕的预实验,目的：从大量的可疑血痕中筛除不是血痕的检材。 基本原理：,预实验的意义,具有过氧化物酶活性的物质广泛存在，如脓液、鼻涕、排泄物、植物汁等。 预实验阳性提示可能是血痕；灵敏度高。 预实验阴性可以排除是血痕。,血痕预实验-联苯胺试验,血痕的确证实验,目的：证明检材是血痕。 原理：血红蛋白或其衍生物检测。,血痕的种属鉴定,目的：确定血痕是否是人血。 意义：动物血中含有与人血遗传标记相似的物质，如A及B样抗原。存在误将动物血判为人血而测定遗传标记。 原理：种属特异性生物分子检测。 种属特异性蛋白抗体人血红蛋白抗体，人血清蛋白抗体； 种属特异性核酸Alu序列。 方法：免疫学、生物化学及分子生物学方法。,种属鉴定免疫学方法,抗人血红蛋白血清 抗人血清蛋白血清 环状沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体相遇且比例合适时，形成抗原抗体复合物，在抗原与抗血清的界面出现可见的白色沉淀环。 酶联免疫吸附试验：辣根过氧化物酶标记抗人IgG单克隆抗体，抗原抗体反应后，通过酶促底物显色。,种属鉴定分子生物学方法,Alu序列 人的Alu序列有别于其它哺乳动物 人的Alu序列引物： Alu9.1 5-GGCACTTTGGGAGGCCAAGG Alu9.2 5-TACAAGCTTGTGCCACCATGCCAAC,种属鉴定分子生物学方法,PCR体系：50l 20ng DNA 10PCR缓冲液5l 0.2mol/ml引物 200mol/L dNTP 1.5mmol/L MgCl2 0.45%Triton-100 1U Taq酶,2% 琼脂糖电泳 EB染色 PCR产物130bp,PCR循环参数： 94变性5min 94 30s 55 30s 循环30次 72 1min 72保温10min。,血痕的个人识别,基因表达产物水平的遗传标记测定 红细胞ABO血型 红细胞酶型 血清型 DNA多态性分析 性别鉴定,血痕的ABO血型检测,特点： 红细胞膜上ABO血型抗原密度高，抗原性强，仅需少量检材就能分型； ABO血型抗原决定簇为糖链，对环境中理化因数的影响有较强的抵抗力，即使陈旧血痕也能分型； ABO血型抗原也广泛分布在人体各种组织器官中，为结果比对提供了广泛的检材来源。,血痕的ABO血型检测 吸收实验,原理： 有A、B抗原时，能与相应的抗-A、抗-B抗体发生特异性的抗原抗体反应，使抗血清中的游离抗体减少或消失，不再与相应的指示红细胞发生凝集反应或凝集反应强度明显减弱。 若血痕中无A、B抗原，则不能抑制抗血清中的相应抗体，抗体与指示红细胞的凝集反应强度不改变。,吸收实验结果判读,血痕的DNA多态性分析,DNA提取：Chelex-100法等 PCR-STR检测,血痕的性别鉴定,X、Y染色质鉴别 性激素检测 HY抗原检测 DNA性别鉴定人类牙釉质基因 （Amelogenin）： Amel-X（Xp22） Amel-Y（Y11p22.2） 人类Amel-X与Amel-Y的内含子长度不同。针对Amel-X或Amel-Y碱基缺失部位设计引物，可以用PCR扩增X、Y特异性片段。,人类牙釉质基因,问题： 用PCR仅仅分析Y或X一种染色体作血痕性别鉴定是危险的。因为缺乏内对照，扩增失败时可能会误将男性判为女性，或误将女性判为男性。如：男性不育者常见Y-染色体微缺失，导致Amel-Y片段丢失。,男性：Amel-X、Amel-Y,女性：Amel-X,Amel-X/Y引物,第三节 精液斑检验,要点提示： 精液斑检验的意义及程序 精液斑预试验 确证试验的原理、方法和意义 DNA多态性检测的价值、条件与结果评价,精液斑检验要解决的问题,可疑斑痕是否为精斑： 预实验、确证实验 是人精斑还是动物精斑： 种属试验 是何人的精斑 个人识别,精斑检验的一般过程,肉眼检查,预实验,确证实验,种属鉴定,个人识别,确定精斑部位： 紫外灯下呈 银白色荧光,提示斑痕可能 是精斑： 酸性磷酸酶- 磷酸苯二钠试验,确证精斑： 精子检出； p30,人精斑？ p30,精斑检验的肉眼检查,深色布类上的浓厚精斑，呈灰白色浆糊状斑迹，较稀薄的精斑则不易察见； 浅色布类上的精斑多呈黄白色地图状，边缘色深。 放大镜检查，可在布纤维表面或中间见黄白色小鳞片。 载体上精斑手触有硬感，新鲜精斑有特殊臭味。,紫外线下发银白色荧光（黄素），边缘呈紫蓝色； 紫外线检查为非特异性检查手段！,精斑预实验,阳性结果提示可能是精斑，不能确证精斑！ 酸性磷酸酶检出磷酸苯二钠试验,精斑确证实验,精子检出： 复染法酸性品红亚甲兰染色 头部呈红色，尾部呈兰色 免疫学试验: p30检出前列腺特异性抗原 具有高度的种属特异性和器官特异性； 保存时间长,精斑的个人识别ABO血型检测,中和试验： 精斑中的水溶性A、B、H物质与相应的抗体结合，使抗体与指示红细胞的凝集反应能力降低或完全消失。 反应系统中加指示红细胞后，若红细胞不凝为中和试验阳性反应，证明精斑中含有与抗体相对应的抗原；红细胞凝集为阴性反应，证明精斑中不含与抗体相对应的抗原。,抗血清的效价一定要标化（2或4为好）； 精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上，证明精斑中含有相应的血型抗原,精斑的DNA检测,精子细胞核是富含二硫基的交联蛋白组成的网状结构，能抵抗各种类型的去污剂作用，对外源性蛋白酶水解也有相当强的抵抗作用，必须在DTT等试剂的作用下，使二硫基断裂，将-S-S-还原成-SH，核蛋白才能被SDS、蛋白酶K分解，释放出DNA。,第四节 其他生物性斑迹分析,细胞成分DNA分析,混合斑分析,Y-STR基因座在混合斑中精液成分的个人识别中的应用优势： 只有男性成分可以被扩增和检测！,第五节 毛发检验,毛发检验要解决的问题有： 毛发还是纤维？ 人毛？动物毛？ 来自人体何部位？ 自然脱落？暴力拔脱？推断致伤物？ 毛发的个人识别,毛发的结构,毛发是皮肤的一种特殊的附属器，是皮肤毛囊细胞产生的一种富有弹性角质体。 毛尖是毛干的游离末端，毛干向毛尖逐渐变细而尖 毛干是裸露于皮肤外部的部分，由角化上皮细胞（无细胞核）组成，中心向外可以分为： 毛小皮：人毛小皮花纹通常为细小波浪状； 毛皮质：人皮质发达； 毛髓质：人髓质不发达、而且髓质不连续。 毛根是埋在皮肤内的部分（含有核细胞） 毛 球：毛根起始端膨大和球状的部分； 毛 囊：包裹毛根的一管状结构，内层为上皮根鞘、外层为纤维组织鞘； 毛乳头：毛球和毛囊末端膨大，底面内凹，含毛细血管和神经的结缔组织。,毛发与其他纤维的鉴别,毛发的主要成分为角蛋白中的硬角蛋白，理化性质稳定。毛发的角蛋白中含有3-5的硫，燃烧时发出特殊的臭味。 肉眼观察毛发与纤维易于区别。有困难时可用显微镜检查，只有毛发才有毛小皮、皮质、髓质三层特有的结构。,毛发与其他纤维的鉴别,捻搓试验 燃烧试验 植物粘胶：连续燃烧，有烧焦气，灰少而飞扬； 毛发：难于燃烧，有特殊的焦气，灰球不飞扬； 合成纤维：遇火收缩； 矿物纤维：不被燃烧。,人毛与动物毛的鉴别,人毛部位的确定,可以根据毛发的长短、粗细、色泽、形状、卷缩方向、末端特征、横断面的形状、髓质的位置以及表面附着物等特点，鉴别不同部位人毛发。,毛发的脱落和损伤,自然脱落： 毛球呈棒状，下方闭锁，无毛囊附着，510%的亚硝基铁氰化钠溶液染色无颜色反应 暴力拔脱： 毛球湿润，毛根常附有毛囊的残片，下端开放或呈沟状弯曲，染色成红色,毛发的钝器伤： 钝器打击时，毛发的损伤程度与致伤工具的质量作用力的大小和毛发依附物体的性质有关。钝器作用部位变宽扁平，皮质纤维分裂，部分断裂或完全断裂。 毛发的锐器伤： 锐器所致的毛发损伤，断面的形态特征与锐器刀口的锋利程度有关。锋利锐器所致毛发断面平滑整齐，毛干不碎裂，皮质纤维不分裂。,毛发的个人识别,形态学观察 微量元素含量 毛发的ABO血型测定 毛发的DNA分析 带毛囊的毛发STR 毛干的mtDNA分析,mtDNA分析,What is mtDNA typing meet the needs of forensic identification with mtDNA typing take caution to mtDNA typing, 每个细胞中线粒体基因组有多个拷贝 母系遗传,mtDNA遗传标记,线粒体DNA的结构,参考序列,1981年在英国剑桥Frederick Sanger实验室首次对人类mtDNA序列进行了全序列测定。这个最初测定的序列作为比对的参考序列，通常被称为Anderson序列或剑桥参考序列。 1999年，Andrews et al对剑桥参考序列所用的胎盘样本进行了重新测序。更正了最初公布序列中的11个碱基。,剑桥参考序列和修正剑桥序列参考序列比较,正确的序列在nt3106nt3107只有一个C，整个线粒体基因组是16568bp而不是最初报道的16569bp。 为了保持历史数据，在nt3107由一个缺失来占据一个位置。 法医学中最常应用的两个高变区的序列没有差异，它涵盖了nt16024nt16365和nt73nt340,参考序列,Anderson et al,1981. Anderson序列（GenBank：M63933）也称为剑桥参考序列（CRS）。过去依据与剑桥参考序列L链比较的差异报告结果 Andrews et al,1999. 修正的剑桥参考序列（rCRS）作为序列比对时的参照标准为16568bp,而不是传统所接受的16569bp Ingman et al,2000. NCBI人类基因组库用线粒体基因组参考序列（RefSeq mtGenome），GenBank中为16571bp, 每个细胞中线粒体基因组有多个拷贝 母系遗传 单倍型传递,mtDNA遗传标记的特点,mtDNA 母系遗传模式,mtDNA分型的法医学意义,在检测个体间的差异上，线粒体DNA不如其他方法有用。但mtDNA对陈旧骨、牙、严重腐败或焚烧的残骸以及单根毛干的检测成功率比核DNA高。 与核DNA相比，每个细胞中含有多个mtDNA拷贝。mtDNA的大拷贝数提高了从微量或严重降解的检材中得到足量DNA的成功率。在仅能得到毛发、骨、牙等组织的案件中，能提取得到的DNA量极少，这种情况下从mtDNA中得到分型结果的可能性远远高于核DNA遗传标记。 除非发生突变，同一母系中的个体具有相同的mtDNA序列。通常mtDNA在很多代当中的传递都是稳定的，通过mtDNA检测可以估计几代人间的亲缘关系。,法医mtDNA分型,个体间mtDNA差异最大的区域在D环区，包括高变区I（HV I，342bp）和高变区II（HV II,268bp）。无血缘关系个体中mtDNA的HV I和HV II区域变化率大约在1-3%，即每100个碱基就有1-3个不同，所检测的610个碱基有7-14个碱基不同。,mtDNA频率估计,在包含N个mtDNA分型的数据库内，观察到一定次数（X）的某一mtDNA分型，其频率（p）用以下公式计算： p=X/N 如果在数据库内未观察到分型，可信区间的上限为：1-1/N 代表可信系数（0.05，95的可信区间），N代表数据库内的个体数 例如,在1148个非裔美洲人分型中，mtDNA型16129A、263G、309d、315.1C观察到两次，调查mtDNA群体数据库时在686个西班牙人分型中未观察到，计算各个样本群体稀有分型如下： 非裔美洲人群：p=2/1148+1.96(2/1148)(1-(2/1148)/11481/2 =0.0017+0.002=0.004=0.4% 西班牙人群：1-（0.05）1/686=1-0.9956=0.0044=0.44%,检材状况不好(数量与质量)与测序技术潜在的误差,使被测样本单个碱基的不同不能作为法医学区分个体的依据。 线粒体DNA遗传标记呈单倍型遗传，整个线粒体基因组相当于一个遗传标记。在法医学实践中，其个人识别能力有限。,take caution to mtDNA typing,第六节 骨骼检验,骨骼检查要解决以下问题： 是否骨骼？ 人骨还是动物骨？ 一人骨或是多人骨？ 人骨的个人识别，包括根据骨骼特征推断死者的性别、年龄、身高，面貌复原与颅像重合及遗传标记分析； 死后经过时间的推测及损伤的鉴定。,骨的确定,肉眼检查： 根据骨骼的解剖学与组织学结构特点及骨骼成分的测定进行判断。 显微镜检查： 骨片镜检，观察有无骨小管、骨板、哈佛氏管等骨组织学特征。 焚烧试验： 表面失去光泽，重量减轻，质地变松脆。,骨骼的种属鉴定,一人骨或多人骨的鉴别,主要根据骨骼的解剖学结构、定位、数目、排列及各骨的连接吻合情况和有无重复骨等进行鉴定。 DNA分析,骨的个人识别,形态观察测量方法 图像分析方法 分子生物学方法,人骨的性别鉴定,骨盆的性别差异,颅骨的性别差异,人骨的年龄测定,四肢骨骨化中心出现及骨骺愈合的时间,耻骨联合面的年龄特征,从骨骼推算身高,将每块骨骼按解剖学位置排列后，测得全身骨骼的高度，再加上5cm软组织厚度，即为死者的身高。 骨骼不完整时须通过回归方程推算。,以左侧肢体部分长骨推算中国汉族男性(21-30岁)身高的回归方程式如下。 身高：2.30X股骨最大长+64.383.48(cm) 身高：2.22X胫骨最大长+85.343.87(cm) 身高：2.54X腓骨最大长+76.153.81(cm) 身高：2.66X肱骨最大长+82.644.13(cm) 身高：2.86X尺骨最大长+92.824.47(cm) 身高：3.49X桡骨最大长+82.714.14(cm),图像分析方法,面貌复原 面貌雕塑法 颅骨侧面描记法 颜面影像复原形态图法 颅像重合,分子生物学方法,X-Y染色体同源特异片段鉴定性别； PCR-STR ； mtDNA识别个体。,骨骼样本的DNA分析过程,埋葬地,表面清洁,抑制物的移除,线粒体DNA 分析,STR 分析,挖掘,软组织处理,人类学分析,制样,骨骼样本的表面污染的处理,骨骼实验室的准备,骨骼的研磨、粉末化处理,DNA 提取,提取后的DNA纯化,PCR后的纯化,PCR,DNA 定量,SNP 分析,结果的评价,新一代测序技术的应用,RTG,3D,死后经过时间的推测及损伤的鉴定,完全骨化后，由骨骼推测死后经过时间比较困难。 主要依据昆虫的侵袭情况、尸体的崩解情况、骨质无机盐含量来推断。 骨骼损伤的形状可长期保存，对于鉴定有重大意义。如颅骨钻孔术后缺损有助于个人识别；根据骨骼损伤确定损伤性质，有助于推断致伤物，判明死因。,第七节 牙齿鉴定,牙齿检查要解决以下问题： 是否人牙齿？ 推断年龄； 牙齿的个体生活特征； 个人识别。,年龄推断,根据牙齿的萌出顺序推断年龄,人类乳牙萌出时间（月）,人类恒牙萌出时间（岁）,根据牙齿的磨耗程度推断年龄,第一、二磨牙(M1、M2)的磨耗度与年龄的关系,个体生活特征,牙齿可反映的个体生活特征有: 叼烟斗、长期嗑瓜子或咬硬物的人，其切牙切端常有相应的磨耗； 长期吸咽、饮茶的人，牙齿表面有烟垢或茶垢； 吹玻璃的工人及木工的牙齿常有职业的印记； 氟牙说明曾在高氟区长期居住过； 槟榔齿以亚热带地区的妇女为多见； 四环素牙常反映儿童时期曾经长期服用四环素类药物。,个人识别,牙科学资料分析方法 牙科学的详细病历是十分重要的个人识别资料。 分子生物学方法 牙髓细胞,第八节 其他组织检验,软组织 腐败程度决定了软组织DNA分析的成败 石蜡包埋组织 甲醛固定的时间决定了DNA分析的成败,第九节 个人识别结果评估,攻击DNA证据的几个方面 一般问题： 实验室无质量控制 技术人员的培训不足 不能提供充分的材料,证据链问题 记录不全 样品保存、转运不当 提交伪证 更改证据,技术问题 实验室未按要求操作 处理不当造成证据的污染 混合样品的分析 抑制检验的因素 谱带“漂移” 方法未经有效性验证,统计问题 群体研究不足 数据库使用不当 不符合平衡规律 位点间连锁,遗传标记 检材处理策略 实验结果解释,基本策略,通过遗传标记分析为案件侦查提供线索, 为审判提供科学证据。 如强奸案，若从被害人阴道拭子中取得的精斑与嫌疑人的不同，这就为排除该嫌疑人提供了证据； 如谋杀案，若测出嫌疑凶器上的血痕与被害人血液具有相同的遗传标记，则在某种程度上支持嫌疑凶器是作案工具的论点。,个人识别原理 1,现场检材 个人识别 不同 排除嫌疑人 嫌疑人样本 遗传标记分型 相同 不能排除 嫌疑人,实验技能,个人识别原理 2,现场检材 个人识别 估计嫌疑人 相同 是现场检材 嫌疑人样本 遗传标记分型 供体的可能性,统计理论,法医遗传标记涉及的统计学分析,概率基础 定义，范围，算法 乘法定律： 多个事件同时发生 P(A)=P(A1)P(A2) 加法定律： 多个事件发生一个 P(A)=P(A1)+P(A2),遗传标记个人识别,系统效能 个案能力,遗传标记个人识别的系统效能,系统效能用个人识别能力(discrimination power, DP) 定量评价。 个人识别能力指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型不相同的概率。 个人识别能力 DP=1-Pi2,个人识别的计算,个人识别能力 DP=1-Pi2 以ABO型为例，A、 B、O、AB表型频率分别为： P1:0.2642, P2:0.3353, P3:0.290，P4:0.110 则： DP = 1-Pi2 = 1-0.26422 + 0.33532 + 0.29052 + 0.11002 = 0.713,STR遗传标记TH01的个人识别能力计算数据,TH01的个人识别能力,DP = 1 - Q = 1-Pi2 = 1-0.148805 = 0.8511950.8512 意味着在成都汉族群体中随机抽取两个无关个体样本，两者TH01分型结果不相同的概率为0.8512,纯粹由于机会导致两者TH01分型结果一致的概率为0.1488。,累积个人识别能力,TDP=1-Q1 x Q2 x Q3 x Qk =1-Qj,遗传标记数目越多，鉴别能力愈强。系统效能愈高,实质是比较现场收集到的法医物证检材与嫌疑人样本，判断是否来自同一个体。 若检材与样本DNA图谱相同，称两份检材的DNA图谱匹配。 两份检材DNA图谱匹配有两种可能的原因： 两份检材来自同一个体； 两份检材不是来自同一个体。理论上来自群体中的一名随机个体，仅仅因为DNA图谱碰巧与检材的DNA图谱相同而出现了匹配。,遗传标记对个案的鉴定能力,随机匹配概率,在法医物证学范畴内, 随机匹配概率方法指的是在假设条件(H0) 下，获得证据DNA图谱的概率。这是一种条件概率。 这个假设简单说就是假定DNA图谱来自群体中一名与嫌疑人没有关系的随机个体。 用竖线分开条件与事件，竖线右边为条件，左边为事件，随机匹配概率可写成Pr (E|H0) 。,随机匹配概率,对于仅由一名个体留下的斑痕，如血痕，随机匹配概率数值上等于人群中这种DNA图谱的频率。 Pr (E|H0) = 1 X P(X) 式中P(X)为人群中这种DNA图谱的频率，以频率估计概率，即为发现这种DNA图谱的理论概率。,正确的理解随机匹配概率非常重要 不是指嫌疑犯以外的人有罪的概率 不是指其他人在犯罪现场留下相关证据的概率 不是指被告无罪的概率 不是指现实社会中能找到和已知基因型完全匹配的概率 随机匹配概率是对一个特定的DNA图谱可能出现在人群中的估计概率。随机匹配概率也可以理解为从一个人群中随机抽取一个样本, 会出现特定DNA图谱的理论概率。,随机匹配概率,随机匹配概率,改变随机匹配概率的叙述方法和意思通常意义下是检举人的谬误或颠倒条件概率的谬误, 如把Pr (E|H0) 理解为Pr (H0|E) 。 典型谬误：所指定的DNA图谱只有0.0001的概率来自除嫌疑人外的其他人 典型谬误：只有0.0001的概率被告