云南红豆杉内生放线菌TAR11活性代谢产物的初步研究.doc

云南红豆杉内生放线菌TAR11活性代谢产物的初步研究538生技术通讯.20一,.2009LERSINBIOTECHNOLOGYVol20No4July,rrrE?doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2009.04.024云南红豆杉内生放线茵TAR11活性代谢产物的初步研究郑法新,程璐,李侠,刘群日照职业技术学院食品工程学院,山东日照276826研究报告摘要目的:初步研究从云南红豆杉植株根部筛选到的一株抗植物病害的内生放线菌TAR11的活性代谢产物性质.方法:以枯草芽孢杆菌为指示菌,以抑菌活性为指标,测定TAR1l发酵液的最小抑菌浓度;用不同温度,pH值处理,了解活性物质的稳定性;用有机溶剂对活性物质萃取和溶解,并用纸层析对活性物质进行初步分类.结果:TAR11发酵液抗菌物质的最小抑菌浓度为0.78%,对温度敏感,在酸性和中性条件下稳定,可被三氯甲烷萃取,能溶于水,甲醇,乙醇,丙酮,乙醚.结论:低浓度的放线菌TAR11代谢产物能强烈抑制枯草芽孢杆菌活性,经纸层析实验初步鉴定为一类碱性抗生素.放线茵TAR11有望开发成为新一代生物药物.【关键词云南红豆杉;内生放线菌;活性代谢产物;抑菌活性中图分类号Q935文献标识码A文章编号10090002(2009)04053803PreliminaryStudyonBioactiveMetaboliteofEndophyticActinomycetesTARllinTaxusyunnanensisChengetL.K.FuZHENGFa-Xin,CHENGLu,LIXia,LIUQM凡RizhaoPolytechnic,Rizhao276826,ChinaAbstractObjective:AstrainofendophyticactinomycetesTAR11whichagainstplantpathogenswasisolatedfromthemotofTaxusyunnanensisChengetL.K.Fu.BioactivemetaboliteproducedbyTAR11wasprimarilyinvestigated.Methods:Usinganti-Bacillussubtilisactivityastheindex,theminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofmetabolitewasmeasured,thestabilityofbioactivemetabolitetreatedwithdifferenttemperaturesandpHwasobserved,thebioactiveingredientswereex?tractedanddissolvedbyorganicsolvent,andsortedbypaperchromatography.Results:TheMICofmetabolitewas0.78%.Theantimicmbialsubstancesweresensitivetothetemperature,andstableundertheacidicaswellasneutralpH.Itcouldbeextractedbychloroform,andwassolubleinwater,methanol,ethanol,acetoneandaether.Theantimicrobialsubstancewasprimarilyidentifiedasakindofbasicantibioticbypaperchromatography.Conclusion:LowconcentrationofthemetabolitesfromendophyticactinomycetesTAR11hasstrongrestraintagainstB.subtills,andtheantimicrobialsubstanceisakindofbasicantibioticwithstrongpolaritybypaperchromatography.TAR11canproduceactivecomponentstoinhibitbacteriumwhichcanbeexploredasonekindofantibioticdrug.KeywordsTaxusyunnanensisChengetL.K.Fu;endophyticactinomycetes;bioactivemetabolite;antimicrobialactivity从放线菌中筛选生物活性物质一直是微生物药物研究的热点,目前大约有2/3的天然抗生素来自放线菌_11.近年来从植物组织中发现了一些新的放线菌菌种,有些内牛放线菌产生新的生物活性代谢物,或产生具有新特性的酶,而对植物内生放线菌与植物宿主及其他微生物之间的关系研究也有新的发现口.另外,从药用植物内生放线菌中寻找新的生物活性物质也日益受到重视.本实验室从红豆杉根部分离到植物内生放线菌TAR11,其发酵液对多种植物病原菌有抑制作用fT.我们以枯草芽孢杆菌为指示菌,以抑菌活性为指标,对红豆杉内生放线菌TAR11的发酵产物进行了最小抑菌浓度,理化性质等的初步研究,旨在为云南红豆杉植物内生放线菌的开发利用提供理论依据.1材料和方法1.1材料从云南红豆杉根部分离的红豆杉内生放线菌TAR11,枯草芽孢杆菌为本实验室保存.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基.改良高氏I号培养基:可溶性淀粉20g,KNO31g,NaC10.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,K2HPO40.5g,琼脂20g,水1L,pH7.27.4.培养基高压灭菌后备用,纯化培养基与分离培养基组成成分相同.收稿13期2009032O基金项目山东省中青年科学家科研奖励基金(2Oo7BSO20l0)作者简介郑法新(1975一),男,博士,讲师,(Email)faxinzheng163.corn郑法新等:云南红豆杉内生放线菌TAR11活性代谢产物的初步研究5391.2TAR11菌株发酵及发酵液预处理菌种经斜面活化后,将孢子用无菌水洗下,孢子悬液接种于黄豆粉培养基,28,160r/min摇床培养5d;发酵结束后,经减压抽滤,上清液于一20保存备用.1_3指示菌茵悬液的制备将供试枯草芽孢杆菌斜面用无菌水洗下菌苔,倒人锥形瓶,振荡使菌体分散均匀,调节至D值为0.2,即成菌悬液,浓度约为3.8xl07CFU/mL.1-4发酵液抑茵活性测定1.4.1抑茵圈直径测定采用滤纸片法,在直径6mm的无菌滤纸片上加人5L发酵液,贴于带菌培养基上,以黄豆粉培养基为对照,细菌于37培养1d,真菌于37培养2d,用十字交叉法测量抑菌圈直径.1.4.2最小抑茵浓度测定以原发酵液浓度为100%,用3%无菌水溶液倍比稀释为50%,25%,12.5%,6.25%,3.13%,1.56%,0.78%和0.39%,用滤纸片法测定不同浓度发酵液的抑菌情况.1.4.3发酵液押茵活性物质对温度和pH值的稳定性取发酵液30mL,分别在30,40,50,60,70,8O,90和100cc水浴中放置30min,冰浴冷却至室温,测定不同温度处理后发酵液的抑菌情况.取发酵液30mL,用稀酸或稀碱将其pH值分别调至3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0和10.0,静置24h后,调至原始pH值,并测定不同pH值处理后发酵液的抑菌情况.1.5抑茵活性代谢产物的萃取及其抑菌活性和溶解性测定发酵液用等体积的三氯甲烷,乙酸乙酯,石油醚,正丁醇进行萃取,搅拌4h后于分液漏斗中静置过夜,分别取上,下层进行抑菌活性测定.发酵液用等体积三氯甲烷萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,30减压浓缩,所得初提物分别用与原发酵液体积相等的水,甲醇,乙醇,丙酮,乙醚充分振荡静置过夜,进行抑菌活性测定.1.6发酵液抑茵活性成分层析1.6.1pH纸层析41将样品点于分别用pH值为2.2,3.O,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0和10.0的缓冲溶液处理干燥后的9条滤纸条上,在水饱和乙酸乙酯的展层溶剂中进行上行纸层析,层析结束后将滤纸条晾干,生物显影.1.6.2捷克八溶剂系统纸层析捷克八溶剂系统为:水饱和的正丁醇;水饱和的正丁醇,内含2%的对甲基苯磺酸;正丁醇:乙酸:水=2:1:1;水饱和的正丁醇,内含2%的六氢吡啶;正丁醇饱和的0.5mol/L(pH7.0)的磷酸缓冲溶液;正丁醇饱和的水,内含2%的对甲基苯磺酸;苯:甲醇=4:1,本系统所用滤纸先用0.5mol/L(pH7.0)的磷酸缓冲溶液处理后晾干;甲醇:水=3:1,水内含3%NaC1,本系统所用滤纸先用5%NazSO处理晾温度()图1温度对TAR11发酵液抑菌活性的影响干.将样品点于各滤纸条上,并在对应的溶剂中进行上行纸层析,层析结束后将滤纸条晾干,生物自显影.1.6_3硅胶G板薄层层析【51将样品点于活化冷却后的硅胶G板,用正丁醇:乙酸:水(3:1:1)为展开剂进行薄层层析,层析后在凝胶成像系统的紫外光下观察活性物质发光情况,生物显影.2结果2.1发酵液最小抑茵浓度采用滤纸片法测定不同浓度发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌效果,结果见表1,发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制活性随着发酵液浓度的降低而逐渐减弱.当发酵液浓度为0.78%时,对枯草芽孢杆菌仍具有抑菌效果;但稀释至0.39%时,抑菌圈即不明显.因此,发酵液对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为原发酵液浓度的0.78%,即将发酵液稀释至1/128.2_2温度和pH值对发酵液抑茵活性的影响由图1,2可见,发酵液中活性物质对温度的耐受性较弱,其抑菌圈随处理温度上升呈现明显的缩小趋势,经70处理30rain后,抑菌圈降到约12mm,之后略有上升,维持在13.8mm左右.发酵液经不同pH值处理后,其抑菌圈在酸性条件下较大,在碱性条件下相对较小,整个pH值范围内变化幅度不大,表明发酵液中活性物质对酸碱的耐受性较强.2-3茵活性代谢产物萃取及抑菌活性和溶解性测定萃取结果见表2,活性物质在原始pH值条件下能被三氯甲烷和正丁醇大部分萃取,乙酸乙酯和石油醚的萃取效果相对较弱.活性物质对不同溶剂的溶解性见表3,活性物质在水,甲醇,乙醇,丙酮,乙醚中都能较好地溶解.萃取和溶解性试验表明发酵液中的抗菌活性物质是一种中高度极性的抗生素.以上试验用各纯溶剂对照均无抑菌圈出现.2.4TAR11菌株发酵液抑茵活性物质的纸层析pH纸层析结果见图3,以水饱和乙酸乙酯,水饱和正丁醇,水饱和乙酸丁酯为展开剂时,活性物质的Rf值都随着pH值的增大而上升,其曲线的最大值在碱性部分,呈现经典的S型.参照各类抗生素纸色谱图,如大环内酯类抗生素呈碱性,四环素类抗生素为二性化合物,B一内酰胺类抗生素为酸性药物,氨基苷类表l不同浓度发酵液对枯草杆菌的抑菌作用(n=5)发酵液浓度(%)抑菌圈直径(mm)发酵液浓度(%)抑菌圈直径(nMl1)l0o23.223.1314.285020.5l1.56l2.O225l9.19O.789.3712.5l7.680-395.786.2515.5l二二.!.一IL+矗1百一pH值图2pH值对TAR1l发酵液抑菌活性的影响巧侣5oE邑圣埘匿掇器加侣伯50一E曼倒暇粗皲540生1Tr技术H通讯.20一.?t12009LERSINBIOTECNOLOGYvol20No4July,20129TrEH?表2不同有机溶剂对TAR11发酵液活性物质萃取后的抑菌活性萃取溶剂抑菌圈直径(mm)三氯甲烷水相有机相乙酸乙酯水相有机相石油醚水相有机相正丁醇水相有机相9.8518.7420.139.2320.0910.5913.48l9.59表3不同溶剂对TAR11发酵液活性物质溶解后的抑菌活性抗生素为碱性,氯霉素类为弱酸性和中性,聚醚类抗生类呈酸性,多肽类呈酸性,可以初步推定活性物质为一类碱性抗生素.活性物质在捷克八溶剂系统中的纸色谱如图4所示,可以看出活性物质在溶剂系统中均有较大移动,Rf值呈现出中间高两端略低的趋势.参照各类抗生素纸色谱图,初步推定TARI1菌株所产活性物质可能是一类新型抗生素.活性物质经硅胶G板薄层层析展开后在凝胶成像系统下观察无荧光出现,经生物显影发现只有1个抑菌圈,其Rf值为O.13,说明该活性物质没有共轭双键和特殊发色团的存在,且为单一组分.1.2100.80.60.4O.2O.0,/7厂/_r,/一水饱和乙融乙酯.+水正丁醇.!=一水饱和乙醚丁酯pH值图3TAR11发酵液活性物质不同展层剂的pH纸层析图1_21.00.8璺0.6t,t-0.4.,./一一.,?/23一一一i.一一.一一溶剂序列号图4TAR11发酵液活性物质捷克八溶剂系统层析图3讨论内生放线菌尤其是链霉菌在植株体内发挥重要作用,作为寄生菌或共生菌存在于多种植物体内16-1,其活性物质能够通过与植物营养的同化作用或产生次生代谢物促进植物生长171,通过竞争生态位点定殖在植物组织内部诱导其系统抗性,并能激活寄主相关基因等机制起到抗病目的ll81.从天然资源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点.放线菌资源在天然资源中占相当大的比例,其活性产物抗生素是微生物农药的重要来源之一.我们从药用植物红豆杉的根部筛选出的内生放线菌TAR11的发酵液对供试枯草芽孢杆菌具有很强的抑制作用,稳定性实验显示TAR11菌株发酵液抑菌活性物质在酸,中性情况下稳定,对温度比较敏感,且活性物质易被三氯甲烷萃取,能溶于水,甲醇,乙醇,丙酮,乙醚,纸层析初步鉴定为一类碱性抗生素,这为对TAR11菌株发酵液抑菌活性物质的进一步深入研究提供了依据.有关该菌株抑菌活性物质的分离纯化,结构鉴定,作用机理等研究工作正在进行中.参考文献f11BullAT.Biodiversityasasourceofinnovationinbioteehnology.AnnuRevMicrobiol,1992f46):219252.【2】lgarashiY,OgawaM,SatoY,eta1.Fistupyrone,anovelinhibitoroftheinfectionofChinesecabbagebyAlternariabrassicioola,fromStreptomycessp.TPA0569J.JAntibiotics,2000,53:1117-1122.f31CastilloUF,StrobelGA,FordEJ,eta1.Munumbicins,wide-spectrumantibioticsproducedbyStreptomyeesNRRL30562,endo-phconKennedianiscansJ.Microbiology,2002,148:2675685.4IngoH,PaulRJ,WilliamF.Neomarinoneandnewcytotoxicmarinonederivativesproducedbyamarinefilamentousbacterium(actjn0mycetales).TetrabedronLett,2000,41:20732076.51CastilloUF,HarperJK,StrobelGA,eta1.Kakadumyeins,novelantibioticsfromStreptoraycessp.NRRL30566.allendophymofGrevilleapteridifoliaJ.FEMSMicrobiolLett,2003,224:183190.f61CastilloUF,Strobe/GA,NullenbergK,eta1.MunumbicinsE-4andE一5:novelbroadspectrumantibioticsfromStreptomycesNR-RL30562J.FEMSMicrobiolLett.2006.255:296300.71郑法新,程璐,李侠,等.红豆杉内生菌的分离及抗植物病害活性物质的初步筛选fJ1.现代农业科技,2009,499(5):104105.8沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验M】.北京:高等教育出版社,1999.9周德庆.微生物学实验教程M.北京:高等教育出版社,2006.10】饶本强,李福荣,张海宾.乳香对几种病原微生物抗性作用的初步研究fJ1.信阳师范学院:自然科学版,2005,18(1):5456.【11李义奎.中药药理实验【M.上