《ChIP实验》PPT课件.ppt

黄文锋,2009年7月27日,主要内容,何谓ChIP实验技术,ChIP技术基本步骤及注意事项,ChIP实验技术的应用,何谓ChIP实验技术,染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是 研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特 异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的 蛋白质的重要方法。,是深入分析癌症，心血管等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。,何谓ChIP实验技术,在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理，,将染色质切成小段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相 结合的DNA片段沉淀下来。通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白,原理,质与DNA相互作用的信息。,何谓ChIP实验技术,主要内容,何谓ChIP实验技术,ChIP技术基本步骤及注意事项,ChIP实验技术的应用,ChIP技术的基本步骤,基本步骤,染色质的断裂,细胞的固定,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转及DNA的纯化,细胞的固定,交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时， 具体时间根据实验而定。,ChIP实验利用甲醛在生理状态下使蛋白质-DNA交联， 形成生物复合体，避免了DNA结合蛋白在染色质上的 重新定位，或者在后续的生化分离中丢失。,甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂,染色质结构本身是动态的， 并且DNA与非组蛋白相互作用常是瞬时的。,注意事项,交联时间过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响实验结果。,交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。,甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。,ChIP技术的基本步骤,基本步骤,染色质的断裂,细胞的固定,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转及DNA的纯化,染色质的断裂,超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引 起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。,交联后的染色质可被超声波切成400600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电 泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。,注意事项,在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的 超声程序，保证低温。,超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生 泡沫。,总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。,ChIP技术的基本步骤,基本步骤,染色质的断裂,细胞的固定,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转及DNA的纯化,染色质免疫沉淀,Input 对照,Beads 选择,抗体的选择,阳性与阴性对照,Input 对照,Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶 序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取 样比例换算出ChIP的效率。,在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经 过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。,必不可少的步骤,染色质免疫沉淀,Input 对照,Beads 选择,抗体的选择,阳性与阴性对照,Beads选择,Magna beads是近年来出现的一种新型beads，它使用方便， 不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单， 而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推 出的Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体 复合物，然后使用Agarose beads（琼脂糖小球）或Magna beads沉 淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次 洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复 合物。,染色质免疫沉淀,Input 对照,Beads 选择,抗体的选择,阳性与阴性对照,抗体的选择,因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合 位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫 沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。,不是所有的抗体都能做ChIP实验的， 只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，,实验成功的关键,染色质免疫沉淀,Input 对照,Beads 选择,抗体的选择,阳性与阴性对照,阳性和阴性对照,阳性抗体和阴性抗体 对照是最基本的实验 对照,阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG。,阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体， 常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。,目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能 得出正确结论。,没有对照就很难对实验结果的可靠性进行评估， 所以实验对照显得尤为重要。,阳性与阴性对照,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能， 所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合 的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。,最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。,注意,ChIP技术的基本步骤,基本步骤,染色质的断裂,细胞的固定,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转及DNA的纯化,交联反应的逆转和DNA的纯化,用不含DNase的RNase和Proteinase K， 65oC保温6小时逆转交联， 经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。,纯化DNA的质量越高，越有利于下一步PCR等方法的检测。,ChIP技术的基本步骤,基本步骤,染色质的断裂,细胞的固定,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转及DNA的纯化,DNA的分析鉴定,如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是 目的蛋白的序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析。,如果目的蛋白质的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因 组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可以采用 Southern 杂交，ChIP克隆和DNA芯片方法。,主要内容,何谓ChIP实验技术,ChIP技术基本步骤及注意事项,ChIP实验技术的应用,ChIP技术的发展,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用， 发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；,从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用， 发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；,从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到 研究结合在DNA序列上的