《CR技术应用》PPT课件.ppt

PCR技术应用,班级：食营检08 姓名：朱丽娟 学号：02 时间：2010-10-10,PQ-PCR,TAIL-PCR,PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。,PCR,诊断 细菌，病毒，寄生虫检测 肿瘤 各种肿瘤检测 研究 DNA测序，分析突变，基因克隆 人类基因组工程 遗传图谱的构建，表达图谱，DNA测序 其他 ,应用范围,病原体测定 肿瘤研究 基因突变及多态性的研究 其他方面,FQ-PCR技术的应用,FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。,FQ-PCR特点,由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。,1.病原体测定,Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。,意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在2831之间时，RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和-球蛋白基因，发现RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P0.01）。,2.肿瘤研究,美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。,3.基因突变及多态性的研究,日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。,4.其他方面,综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。,摘要 热不对称性PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR) 是一种用来分离与已知序列邻近 的未知DNA 序列的分子生物学技术。 该技术利用3 个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组 合进行PCR 反应，选择恰当退火温度对目标片段进行PCR 扩增。 TAIL-PCR 技术作为一种使用技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异 性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分子生物 学研究领域广泛应用。,TAIL-PCR技术,是以基因组DNA 作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer, SP)，和一个较短且Tm 值较低的随机简并(arbitrarydegenerate,AD)引物组合，通过3 轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR 扩增，获得已知序列的侧翼序列,TAIL-PCR技术原理,TAIL-PCR包括3轮PCR TAIL-PCR 反应条件,注 * ：25 保持180 s 后以0.3 /s 升温至72,TAIL-PCR引物设计,和一般的PCR 反应相比，TAIL-PCR 反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。特异引物设计：3 个嵌套的特异性引物长度一般在2030 bp 之间，Tm 值一般设为5868 。SP1、SP2 和SP3 之间最好相距100 bp 以上以便在电泳时更容易区分3 轮PCR 产物。若是设计T-DNA 插入序列的引物，为了保证T-DNA 在转移过程中不被切去，至少要保证SP3 的3 端距T-DNA 的边界在l00 bp 左右。简并引物设计：简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14 bp左右，Tm 值介于3048之间。AD 引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸序列组成有很大关系。为了更好的与目标序列退火：首先，尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区，如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子，核苷酸的简并性一般选择在64512 倍之间；其次，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性；最后，尽量避免3 末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3 末端不要位于密码子的第三位；另外，在一些多义位置可以使用脱氧次黄嘌呤代替简并碱基。,TAIL-PCR反应条件,在整个TAIL-PCR 中，引物设计固然重要，三个循环PCR 的各组分的工作浓度也是不可忽视的。经典的TAIL-PCR 中，第2 次和第3 次反应的模板都由前一次PCR 产物按1/1 000 进行稀释所得，但在实际的PCR 反应中，为了得到更好的实验结果，笔者认为优化每一轮产物的稀释倍数是必要的。另外在反应体系中，特异性引物的浓度与普通的PCR 相同，简并引物的浓度要高，一般为2.05.0 滋mol/L，以满足引物的结合效率,TAIL-PCR反应混合液组成,TAIL-PCR技术的优缺点,TAIL-PCR 优点：(1)操作简便，省时：直接用基因组DNA为模板，而且TAIL- PCR 对模板的数量和纯度的要求不高，只需几个ng 的DNA 即可。整个TAIL-PCR 反应可在一天内完成，可以快速获得目标片段，简便快捷。(2)成本低：传统基因克隆中的RT-PCR、RACE 技术对实验技术和样品要求高，RNA 的提取、纯化、反转录等操作过程费时费钱，而TAIL-PCR 只需要设计几个嵌套特异引物和简并引物即可，大大降低了成本。(3)高特异性和高灵敏性：用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使反应体系有利于特异引物的扩增，最终的扩增产物中目的片段占绝对优势，反应产物可以直接用做探针标记和测序模板，这一点是靶基因步移PCR 和单引物PCR(Parks et al., 1991)无法与之相比的(非特异性产物带来的高背景)。使用任何一个AD 引物，在60%80%的反应中都能够产生特异性产物，运用不同的AD 引物就能够有效地扩增到目标片段 TAIL-PCR 缺陷：(1)反应条件设置要求精细，因为TAIL-PCR 是3 轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直接影响下一循环的工作，以至得不到理想的结果。(2) TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合，因为不同的AD 引物具有不同的结合位点。(3)TAIL-PCR 反应不是每次都有阳性结果。因为AD 引物存在有限的结合位点，在个别侧翼序列的扩增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结果。,TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景,传统的植物基因克隆方法大多具有实验周期长,工作量大且 技术步骤烦琐等不足。图位克隆技术建立在遗传分析和基因 定位的基础上，但这一技术耗工耗时；基因组减法技术，要 求缺失突变体与其未缺失同源亲本只有12 个DNA 片段的差 异，若2 个材料的核DNA 差异不显著，很难获得我们需要的 目的基因；转座子标签法首先需要一个已克隆好的功能转座 子，插入突变使某一基因失活，然后进行植物杂交并筛选突 变体，并且还需鉴定突变体是否由转座子插入而产生，实际 操作比较烦琐。, 近年来，TAIL-PCR 技术以其上述独特的优点逐渐被广泛应用于植物基因侧翼序列的克隆及获取全长的研究中，目前已成功的从P1、 YAC 和BAC 克隆中获得插入末端的DNA 序列和拟南芥的T-DNA 侧翼序列(Liu andWhitter, 1995;Liu andHuang, 1998)。随着TAIL-PCR 方法的优化，应用更加广泛。宋达峰等(2005)年将第三轮反应中的普通的PCR 循环换用热不对称PCR 循环，以改进的TAIL-PCR 方法从3 个转基因烟草后代植株中成功扩增出T-DNA 插入位点的全长335 bp 的侧翼序列。Wang 和Gao (2006)通过改进的TAIL-PCR 方法克隆非洲紫罗兰(Saintplia ionantha)两侧对称栽培种中CyC 类基因的5 未知序列，并进而从两侧与辐射对称栽培种中分离得到苦苣苔科(Gesneriaceae)中第一组完整基因：SiCYCIA与SiCYCIB。2006 年，王海燕等根据已扩增出的Lr35相关基因组DNA 片段RGA1 设计3 对特异性引物,利用TAIL-PCR 对小麦抗叶锈病基因同源序列RGA1 侧翼序列的扩增，将RGA1 序列有效延伸至915 bp，为克隆目的基因Lr35 奠定了基础。陈军营等(2007)在前人的基础上，省去第1 次TAIL-PCR 前的l0 个低严谨度的PCR 循环，成功地从小麦基因组DNA 中克隆到全长为748 bp 的小麦GLP3 基因的上游侧翼序列。李丕顺等(2008)以红莲型水稻不育系粤秦A (YTA)线粒体DNA 为模板，在具有细胞质遗传的线粒体特异性片段HL-sp 侧翼各设计3 条特异性巢式引物，通过扩增和序列分析得到了HL-sp5 侧翼l 456 bp 和3 侧翼2 570 bp 的序列。,随着分子生物学理论