解剖小白鼠实验.ppt

细胞原代培养 (Cell primary culture),实验目的,了解细胞体外培养的原理、基本方 法，了解无菌操作方法及注意事项。 学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况。,实验原理,用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。,消化培养法,又称为组织消化分散法：将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。,实验仪器,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器，除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,滤器工作原理,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。 箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,倒置显微镜,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,培 养 板,培养瓶,实验材料,2月龄的小鼠,实验试剂,（1） 1640-RPMI培养液 （2） 小牛血清 （3） 青、链霉素 （4） PBS液 （5） 5NaHCO3 （6） 75酒精,实验步骤,一、培养前的准备工作 （1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 紫外线消毒 （4） 洗手和着装 （5） 进入无菌室,实验步骤,动物细胞原代培养过程图,方法与步骤,（1）动物拉椎处死 （2）取肝及剪碎：剖开腹部，将肝脏取出，放入小培养皿中，用PBS液洗涤1次；将肝剪成1mm大小的块，再用PBS液洗涤2次，直到液体澄清。,（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入试管内，加入的0.25胰蛋白酶液，完全没过组织，置37水浴中消化20 30min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，取上清液至另一试管中。,（4）观察与计数：从细胞悬液中取出1滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的数目。看到球型的细胞，证明消化下来细胞，实验成功。,作业:,1.在细胞培养过程中如何防止污染?,无菌操作的几个注意事项,1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。,7、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中