分子生物学实验原理.ppt

分子生物学实验原理,第一节 分子生物学发展概述,分子生物学molecular biology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。 1950年，Astbury在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。 广义和狭义之分 医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理。,分子生物学理论与实际应用的成就 理论方面 1.关于肿瘤的发生： 提出了肿瘤起源于细胞增殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系的紊乱。 癌基因：100多种；抑癌基因：20多种 细胞周期调控系统 细胞凋亡 端粒酶,2.关于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗 3.关于慢性病chronic disease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了相关基因及其多态性。 4.关于生长、发育与进化的统一理论，也深入到了分子水平。,实际应用方面,1.转基因植物 目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的基因有100多个。 抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环境因素（抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗涝）、提高作物的产量、提高蛋白质含量、改善氨基酸构成等。,2.转基因动物 1983年，超级小白鼠，体重是正常鼠的2倍。随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂。 3.基因工程多肽药物与疫苗 主要指DNA体外重组技术所研制的产品，转基因动物和植物所研制的产品，以及蛋白质工程技术所研制或改进的产品。,4.基因诊断与基因治疗 基因诊断gene diagnosis是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断的方法。 目的物：DNA或RNA 方法：核酸分子杂交技术、PCR技术、 DNA芯片技术 疾病：遗传性疾病；传染病或感染性疾病,基因治疗gene therapy 指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的。 治疗疾病： 遗传病 恶性肿瘤 传染病,5.环境监测与净化 area survey and depollution 监测：可检测环境中的病毒和细菌 净化：改造细菌分解环境中的石油、残留的农药和有毒金属 6.克隆动物Clone animal 1997年“多利”克隆羊 克隆器官（干细胞stem cell技术）,7.人类基因组计划human genome project;HGP 1990年，美国国立卫生研究院（NIH） 和美国能源部联合发表了人类基因组计划。 30亿个碱基对，估计有3万4万个人类基因。 2000年6月26日，首次绘成人类基因组“工作框架图” 。 2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。,意 义 与“阿波罗”登月计划相媲美 1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特柯特认为，20世纪是物理学和化学的世纪，21世纪将是生物学的世纪。 推动分子生物学更加快速地发展：蛋白质组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学及各种计划,对其他相关学科的影响,1.向其他学科渗透 2.形成了许多新兴的边缘学科 基础医学方面：肿瘤分子生物学、免疫分子生 物学、神经分子生物学等 预防医学方面：分子营养学、分子毒理学、分 子流行病学、遗传流行病学、人 类基因组流行病学、 公共卫生 遗传学,在预防医学中的应用及发展方向,1.慢性病的研究 慢性病的发病原因绝大多数是基因与外界环境因素相互作用的结果。 2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及“三致”毒性的研究：生物标志物的研究和评价方法的建立 3.环境监测与污染物的净化。,4.遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊断（表型预防）。 5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划（环境基因组学） （1）环境应答反应基因 （2）筛选多态性及易感性 （3）根据易感性制定不同的干预计划,一、分子生物学一些重要的理论知识,1.分子生物学发展史上一些重要的事件 （1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel根据豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即遗传的分离律和自由组合律。 （2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念。 （3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因（gene）。,（4）1910年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。 （5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离出细菌 DNA，并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。 （6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次使用了 “分子生物学” 术语。 （7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。,（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破译了DNA遗传密码，1966年 破译了64个遗传密码。 提出了遗传信息由DNA RNA蛋白质传递的中心法则。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。 （10）1970年，发现了逆转录酶。 （11）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。,（12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。 （13）1973年，重组DNA技术问世。 （14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术 （15）1990年，人类基因组计划。,2.三个重要理论important theory (1)DNA的结构、复制、中心法则 基本构成单位是核苷酸 核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。 碱基分别是腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。 相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连 进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构,RNA与DNA有如下不同点： 五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)； 碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶 RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭环的DNA分子)。,DNA(或RNA) 结构给我们的启示 DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们保留的是水相、而不是有机相。 核酸是两性电离，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点(PI)为22.5。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉),DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒)，所以应注意提取方法的不同 由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率不同。 根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针杂交。 由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。,在解旋酶的作用下，打开DNA双链 在特定的复制起始点 以每条DNA链为模板 在DNA聚合酶的催化下 以4种脱氧核苷酸为前体物，合成一条互补DNA链。 DNA的复制双称为半保留复制。,DNA的复制,DNA 半 保 留 复 制,DNA在复制起始点，由解旋酶打开双链，形成复制叉，合成新链的方向为5-3端 前导链与后随链 后随链的合成是不连续的。 先合成RNA引物 再合成不连续的小片段(冈崎片段，1001000核苷酸长度) 最后在DNA连接酶作用下，将小片段连接起，形成完整的DNA链。,DNA 半 不 连 续 复 制,DNA的复制给了我们一些启示 PCR技术的原理：在体外要靠温度(90以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。 检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。,遗传信息的传递是： DNARNA多肽(蛋白质) 在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA蛋白质 以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达(expression)。,中心法则,中 心 法 则,转录(transcription) 以DNA为模板，合成RNA的过程。 非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。 转录的过程大致是这样的： 以DNA一条链为模板， 诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA 当遇到转录终止信号时，转录即停止。,有意义链,反义链,转录后的初级产物剪切掉内含子，并将外显子连接起来，这样才能变成成熟的RNA分子 还需要在5-端加一个特殊的核苷酸，7-甲基鸟嘌呤核苷酸，这个过程叫戴帽 另外，mRNA的，这一过程又叫穿靴， 3-端还要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸化。 同一机体不同的细胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同细胞的表达是不同的，具有组织特异性，使不同的细胞具有不同的功能,由RNA 蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合酶II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译成蛋白质。 基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个密码子。 在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNA上的三联密码子。 mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三联密码子指导合成蛋白质。 翻译后的蛋白质需要加工修饰。,中心法则给了我们一些启示：,遗传信息由DNA上的基因决定。一旦基因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。 mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。,基因的表达有组织特异性，且受许多因素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。 因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。 这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白)表达时，一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达。,根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根据mRNA的3端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。 根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。,（2）基因表达调控 以乳糖操纵子学说为例 乳糖操纵子的基本组成元件,调节基因 结构基因 I P O ,抑制基因(I) ：是阻遏物编码区 启动基因(P) ：有cAMP受体蛋白(CRP) 和RNA聚合酶的结合位点 操纵基因(O)：是阻遏物结合位点, ：-半乳糖苷酶结构基因 ：透过酶结构基因 ：转乙酰酶的结构基因,调节方式 当乳糖时,cAMP含量增高 cAMP与CAP (分解产物激活剂蛋白)结合成CRP 该复合物与启动基因上对应的位点结合后 使DNA双链不稳定；随后RNA聚合酶则容易与启动基因紧密结合；若此时操纵基因上无阻遏物，则基因被打开 RNA聚合酶从DNA的5端开始滑动，即开始转录，并合成了3种酶。,当葡萄糖cAMPCRP RNA聚合酶则不能与启动基因结合，也就不能转录和合成3种酶。 抑制基因转录和翻译成阻碍蛋白，并与操纵基因结合,阻止RNA聚合酶滑动而抑制转录。这种情况又称为负调节 如果阻遏蛋白与诱导物结合(此处为乳糖) 。则这个复合物不能与操纵基因结合，转录和翻译就能进行。,操纵子学说扩大了基因的概念。即结构基因和调节基因 调节基因发挥正、负调节受细胞内外环境因素的影响。形成了基因调控和表达的概念。 基因表达调控理论，不仅有助于理解生命现象的本质，而且对基因工程的建立是至关重要。,（3）DNA重组(基因工程) 基因工程的两个重要工具： 一是内切酶，能特异地识别DNA的碱基序列，并在DNA链当中将DNA切开。 二是载体，如质粒、噬菌体、病毒。 载体的共同特点： 环状DNA；都能专一感染某一类细胞；具有某种选择性标记；都具有一些内切酶位点；都能随着染色体的复制而复制，随着细胞分裂而扩增。,基因工程的基本程序： 取得所需要的目的基因； 将目的基因同载体连接； 再将这个重组环状DNA引入受体细胞(或称寄主细胞)； 使目的基因得以表达，即基因转录和翻译成蛋白质。,第二节 核酸的提取技术 extractive technique of nucleic acid,1. 结合状态 2.形态：分线形和环形；分双链和单链 3.分布： DNA分布在细胞核和细胞； RNA 分布在细胞质、细胞核和细胞器,（一）核酸在细胞中的存在状态和分布,（二）核酸分离提取的原则、要求 1.原则：(1)应保证核酸一级结构的完整性； (2)排除其它分子的污染，纯度要高。 2.对于核酸纯度的要求： (1)对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用 的有机溶剂和过高浓度的金属离子； (2)其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子 污染应降低到最低程度； (3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA时， 应去除RNA，反之亦然。,3.注意事项 (1)尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏 (2)减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在pH410条件下进行。,(3)减少物理因素对核酸的降解。物理因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡，搅拌等。常规操作温度为04。 (4)避免生物因素对核酸的降解。细胞内外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在广泛、稳定，极易降解核酸。因此提取过程中，应注意采用核酸酶抑制剂和破坏方法。,(三)DNA的提取、纯化 真核细胞染色体DNA的制备(提取、纯化) 根据不同的实验要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒缠绕法，异丙醇沉淀法等。但这些方法在基本原理及大致步骤上是基本相同的。而且酚抽提法比较经典常用，下面就以此方法为例进行介绍。,酚抽提法 酚抽提法的基本原理： 用SDS和蛋白酶K破坏和消化细胞 用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质 通过盐和乙醇沉淀获得DNA。,试剂： 1 磷酸盐缓冲液PBS 2 DNA抽提缓冲液： 10mmol/L Tris.cl (缓冲溶液的pH值，pH8.0)。 0.1mol/L EDTA(金属离子络合剂，可抑制DNA聚合酶活性)。 20g/ml 胰RNA酶(破坏降解RNA) 0.5% SDS(表面活性剂，破坏细胞) 。 蛋白酶K (消化细胞、破坏细胞),320mg/ml蛋白酶K，消化细胞，破坏细胞 4酚（用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0饱和），主要作用是沉淀蛋白质等 510 mol/L NH4Ac，其作用是沉淀DNA 6乙醇，其作用是沉淀DNA 7TE（Tris和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液 8透析液： 50 mmol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0,样品前处理 (1)生物组织：新鲜的生物组织，先用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织，吸干血液。若不能马上进行DNA提取，可将生物组织贮存于液氮中或-70冰箱中。 a.取13g左右的组织，用8层纱布包好，外层再包多层牛皮纸，浸入液氮中使组织结冻，取出后用木锤将其敲碎。 b.将敲碎的组织放入搪瓷研钵中，加入少许液氮，用研杵碾磨。需反复添加液氮。,C.在离心管中加入10ml DNA抽提液，用玻璃棒边搅动边加入组织粉末，然后37保温1小时。(先加抽提液，后加组织粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金属棒，减小损伤DNA的机率，37保温1小时，一方面有利于SDS破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度达到37，为下一步反应准备适宜条件)。,(2)培养的细胞 a.收集细胞，悬浮培养(生长)的细胞；可以直接经1500g离心(4,10分钟)，以收集细胞；贴壁生长的细胞，用胰酶消化后再离心收集。细胞数应在5107左右。 b.漂洗细胞，将离心沉淀的细胞用冰预冷的PBS液或生理盐水，漂洗1次再离心，弃上清收集细胞。可重复漂洗1-2次(目的去除培养液成分和细胞分泌的蛋白) c.保温，再用10ml DNA抽提液将细胞沉淀悬浮，并在37保温1小时。,(1)消化 向上述预处理好的样品溶液中(样品溶解在DNA抽提液并保温1小时)，加入20mg/ml的蛋白酶K，至终浓度为100g/ml，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，使溶液至粘稠状(细胞破裂，蛋白、核酸释放)。将反应液在50水浴上，保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时轻轻摇匀反应液。,DNA提取步骤,(2)加酚混匀 将反应液冷却至室温，加入等容积已饱和的酚溶液，轻轻地上下转动离心管，混匀两相，反复该动作10min，直至水相与酚相混匀并成乳状液。若没有达到这种效果，可用多角度振荡器温和地混匀1小时 (3)离心 室温5000g，离心15min，使两相分开(水相在上层，酚相在下层)，(DNA在水相，因水溶性，带负电荷)。 (4)取上层水相用酚重复抽提两次，取上层水相时，应用大口径(0.3cm)吸管，因水相粘稠,(5)又分两种情况 a.透析处理：为提取大分子量DNA(200Kb以上)，在第3次酚抽提后，将DNA溶液装入透析袋中，并放入4透析液中。每次透析液1升，换4次透析液，直至透析物OD270小于0.05，才算透析完毕。 b.沉淀处理，对于100150Kb大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，加入0.2倍容积的10mol/L乙酸铵和2倍容积95%乙醇。室温下轻轻摇动，立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现，用一个前端为钩状的玻璃棒(挑)出DNA纤维，立即放入70%乙醇中漂洗2次。室温5000g，离心5min，弃上清。室温下挥发残留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TE(pH8.0)溶解DNA 1224h 。,(6)测定样品在260nm和280nm的OD值，计算DNA含量和A260/A280比值。 260nm处，是核酸的最大吸收波长，在280nm处是蛋白质最大吸收波长。 在260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA或RNA为40g/ml。因此根据核酸的OD值，计算核酸样品的浓度或含量。,根据A260/A280比值，可判断所提取核酸(DNA)的纯度。DNA纯度比较理想的比值是1.8，RNA比值是2.0。若DNA比值高于1.8，说明有RNA的污染，低于1.8或1.75，则认为是蛋白质或酚污染。RNA比值小于2.0，则认为也是蛋白质或酚的污染。 DNA样品纯度不符合要求(尤其是A260/A280比值小于1.8时) 可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提2-3次， 用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚。 最后用盐和乙醇沉淀，用TE溶解。,本方法需要说明的几点： (1) 5107细胞提取产量为200g左右。 (2)对于上层水相比较粘稠，吸取上层水相时，会牵动两相之间的蛋白质沉淀层。此时可用吸管插到管底吸取酚相(采用负压)，至蛋白质层时，停止。并离心(5000g,20分钟)，沉淀蛋白质，吸取上清液。 (3)由于0.5% SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故应加大该酶用量，一般为20 g/ml (4)所用酚，应重蒸酚，并用水饱和。,（四）RNA的分离与纯化,1. 创造一个无RNA酶(RNase)的环境 RNA酶在环境中无处不在：空气中灰尘、微生物，人体汗液、唾液，以及各种器皿和试剂等，均存在RNase 。 RNase非常稳定，耐热、耐酸，耐碱。蛋白质变性剂可使之暂时失活。 RNase活性不需要辅助因子，因此EDTA对此酶无抑制作用。,(1)去除外源性RNase的污染 空气中的细菌、霉菌等微生物都含有RNase，所以整个操作过程应在比较清洁的环境中进行。因此有必要对操作场所的空气进行消毒。 操作者操作应戴口罩和手套、带帽子。 玻璃器皿常规洗净后，应用0.1%DEPC(二乙基焦碳酸盐)浸泡处理(37，2h)，再用灭菌去离子水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后250烘烤4h以上或200干烤过夜。,塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品。Eppendorf管，微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压消毒。 所有溶液应加DEPC至0.05-0.1%，室温过夜，然后高压消毒。以去除残留的DEPC。 RNA提取所用的酚，应单独配制和使用。配制饱和酚盐溶液时，使用的水应预先以DEPC处理且高压消毒，酚饱和以后，加入8-羟基喹啉至0.1%。8-羟喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。,DEPC的分子式为C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙基焦碳酸盐。是一种粘性液体，对核酸酶有很强的抑制作用。 作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 DEPC又能与RNA或单链DNA反应，破坏单链核酸中大部分腺嘌呤，但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性的浓度大100-1000倍。 使用DEPC的一个原则是，在达到使用目的后，一般要高温处理以便破坏除掉DEPC，使DEPC不与RNA接触。,DEPC可与Tris发生反应，分解成CO2和乙醇，使pH值下降（所以要去除） 配制Tris溶液时，先将所用水用DEPC处理高压消毒 配完Tris溶液后，再经高压消毒。 DEPC与肝素联合使用，增强使用效果。 DEPC应在4或液氮中保存，以防降解。,(2)抑制内源性RNase的活性。 细胞裂碎的同时，RNase释放出来。 原则上应尽早去除细胞内蛋白，加入RNase抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效地抑制。 不同组织细胞中内源性RNase的数量不同，胰腺、脾组织细胞中RNase的含量极为丰富，在对这些组织提取RNA时，更要使用强有力的RNase抑制剂。,抑制剂可分为以下几类： 低特异性RNase抑制剂，如皂土、复合硅酸盐、肝素、多胺等，因作用较弱，现已不大使用。 去除蛋白质物质 蛋白质变性剂，蛋白K、阴离子去污剂，常与RNA酶抑制剂联合使用，以加强对RNase的抑制作用。凡能破坏蛋白质的物质，对RNase均有一定作用，因为酶本身就是蛋白质。,a.酚、氯仿 这类有机溶剂不但能使核蛋白与核酸解聚(但不能破坏核酸)，而且对蛋白质有变性作用。因而对酶(RNase)有抑制作用。酚不能完全抑制RNase活性，但酚一般都加入了8羟基喹啉(一种抗氧化剂，一种指示剂)，因而加强了对RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比较强，因此酚与氯仿常联合使用。 蛋白酶K也能抑制RNase活性。有一种情况挺特殊，即该酶在12的SDS存在下，其活性反而会增加。,b.去污剂 包括SDS(十二烷基硫酸钠)，十二烷酰肌氨酸钠，脱氧胆酸钠等阴离子去污剂。这些阴离子去污剂可使核酸与蛋白质解聚，并可与蛋白质侧链上带正电荷的基团结合，在高浓度KCl存在下，形成SDS蛋白质复合物而沉淀。 c.解偶剂（胍类）盐酸胍，异硫氰酸胍，作用非常强的一种蛋白变性剂，可完全破坏蛋白质二级结构，从而使细胞结构降解，核酸与核蛋白分离，所以又称解偶剂。, RNase的特异抑制剂 a. RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一种酸性糖蛋白可与RNase以非共价键的形式结合，从而抑制RNase活性， RNasin最好不与蛋白质变性剂一同使用，因变性剂亦可破坏RNasin ，从而使其丧失作用。但可与二巯基乙醇一同使用，可增强RNasin的使用效果。 b.氧钒核糖核苷复合物，这也是一种RNase特异性抑制剂，几乎可完全抑制RNase的活性。 为达到完全、彻底抑制RNase活性的目的，常联合使用，而且有些抑制剂(去除蛋白质物质)一般有4种作用；破坏细胞膜，使核酸与蛋白质分离，沉淀蛋白质、抑制RNase活性。因此几乎包括了RNA提取、分离、纯化的所有目的。,2.RNA的分离、提取方法 步骤： (1)创造一个无RNase环境； (2)组织或细胞的匀浆，同时得加入RNase抑制剂 (3)裂解细胞； (4)去除蛋白、DNA等大分子物质； (5)沉淀RNA； (6)漂洗； (7)溶解RNA。,酚：使核酸与核蛋白分离、变性沉淀蛋 白质，抑制RNase活性。 异硫氰酸胍：破坏裂解细胞，使核酸与核蛋白分离，变性沉淀蛋白质，同是具有很强的RNase抑制作用。这是一个关键的试剂，由于它是万能的，所以实验步骤变得简单。,Trizol试剂盒所提供的试剂：,自己需要配制的试剂,氯仿：蛋白质变性作用，增强对RNase抑制作用。 异丙醇：沉淀RNA。 75乙醇：漂洗、去除盐、残留有机溶剂等杂质。 无RNase水或0.5%SDS溶液(后者较好)(必须用DEPC处理)。,匀浆化 a.组织：取50-100mg组织放在匀浆管中，加1ml Trizol试剂，然后进行匀浆，此时裂解细胞和RNase抑制同时进行。 b.贴壁生长细胞：倒掉培养液，然后直接向培养瓶(皿)中加入Trizol试剂(按10cm2加1ml Trizol试剂计算加入量)。 c.悬浮生长细胞：离心收集细胞，然后加入Trizol试剂（按510106或1107细菌加入1ml比例计算加入量)。,操作步骤,两相分离 将匀浆化的样品在1530环境中放置5min，以便核酸蛋白复合物充分解聚。（加Trizol试剂之前，样品一定要保持低温，防止RNase 发挥作用，在研磨过程中可加液氮）然后按每1ml Trizol试剂加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿。盖紧试管盖，用手剧烈振荡15秒，之后在1530条件保温23min。离心：12000g离心15min，离心时温度要控制在28。（12000g离心是一个关键步骤，也是该方法独到之处，可将蛋白质，DNA等大分子沉淀)。离心之后，就会形成三相：下层是红色的酚和氯仿（含有蛋白质和DNA）；中间层是白色的DNA和蛋白质沉淀；上层是水相，RNA就在此层，水相大约占总体积的60, RNA沉淀 将水相转移到一个新的试管中，并加入异丙醇混匀，加入量按每ml Trizol试剂加0.5ml异丙醇计。在1530条件下，保温10min。然后在28条件下，12000g离心10min，此时就会在管底或底部边上出现RNA沉淀，离心之前，RNA沉淀通常看不见，离心之后常常可看见胶样沉淀。 RNA漂洗 移去上清液，加入75乙醇至少1ml，涡旋振动几次，然后以7500g离心5min(温度28)，又可形成RNA沉淀，并移去上清液。,重新溶解RNA 将RNA沉淀在空气中放量510min，以便挥发掉残留的乙醇。注意干燥时间不宜太长，以防RNA完全干燥。完全干燥的RNA很难溶解。最后用无RNase水或0.5SDS溶液溶解RNA，并用移液管吹打几次，并在55 60保温10min，以便使RNA完全溶解。,判定纯度和计算含量，用紫外分光光度计测量溶液的吸光度质（A）。 A260/280在1.61.8之间表明比较纯净，符合实验要求。 1OD值40g RNA,据此再计算RNA含量。,一般来讲，该方法可从1mg组织中提取的RNA含量分别为：肝和脾为610g ；肾34g ，肌肉和脑为15g ，胎盘14g 。对培养的细胞来讲，1106个上皮细胞中可提取815g ，成纤维细胞57g 。 用Trizol试剂盒法提取的RNA，基本上可满足所有实验的需要，如Northern blot，斑点杂交，mRNA分离、体外翻译，分子克隆等。 该方法操作简便，提取的RNA完整，整个提取过程仅需1h，故现在广泛使用。,第三节 核酸分子杂交技术,1.探针的概念：在化学及生物学意义上的探针(Probe)，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知(检测到)。所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，并带有标记物，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测（可定性、定量）。,(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记,2.探针的种类、选择及特点,种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探 针、寡核苷酸探针 选择：寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷 酸片段，并带有标记物 特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低,设计寡核苷酸探针应遵循的（以下）几个原则： 探针长度：一般要求1050bP。过短则特异性降低，过长，则合成困难、杂交时间延长，亦会出现非特异性杂交。应不短不长。 （一般20bp） G：C碱基对含量应占4060；过少，则不易杂交，或杂交双链不稳定；过多，则会产生非特异性杂交，应不多也不少。（一般AT、GC各占50%） 探针内部的互补碱基对不应大于4bP，否则会形成探针内部的“发夹”结构。 同一碱基的连续出现次数不应超过4次。 探针设计完后，最好利用基因库软件进行分析，并与已知的各种基因序列进行同源性比较，如果该探针与非目的基因序列有70以上的同源性，或连续有8个以上的碱基序列相同，则应重新设计探针序列。,3.探针的标记物与标记 标记物： 放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性标记物：半抗原（生物素、地高辛）；配体；荧光素；化学发光物,根据待测核酸分子存在的部位不同，可分固相 杂交（膜上印迹杂交、细胞原位杂交）和液相杂交。 其中膜上印迹杂交应用广泛。 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到 一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的 核酸探针进行杂交的过程。,（二）杂交,首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上（转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变）。 再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。 最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置及量的多少。 概括起来，杂交主要包括三个步骤：印迹、杂交和检测。,膜上印迹杂交的基本操作流程,1.印迹技术,印迹技术是指将待测核酸分子转移并结合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：选择良好的固相支持物；有效的转移方法。, 固相支持物的选择,具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性强，以便操作 时不易损坏； 具有较强的结合核酸分子的能力； 与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应； 与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操 作过程，而不会脱落或脱落极少； 非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也易被洗脱掉。,硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 化学活化膜 滤纸 其中前2种更为常用,目前常用的固相支持物,硝酸纤维素滤膜,具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力，特别是在高盐浓度，其结合力可达80g/cm2100g/cm2。这种结合主要靠疏水作用。非特异性吸附核酸（探针）能力较弱，因此杂交信号本底值较低。 常用于Southern、Northern斑点印迹及克隆筛选等实验。,缺点： 与核酸的结合力较弱（因为是靠疏水作用），在杂交及洗脱的进程中，核酸会慢慢脱落，特别是在高温情况下，更容易脱落，从而使杂交率下降。另外硝酸纤维素膜对于小分子量DNA片段结合力更弱，因此不太适合小分子DNA片段的杂交。 硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后更易破损，因此操作不方便，须特别小心。 另外值得注意的是，硝酸纤维素膜与核酸的结合，有赖于高盐浓度，而高盐溶液又不适合于电转印迹法（电流大，产热）。,尼龙膜,尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型。有的尼龙膜未经特殊处理，叫普通尼龙膜。有些则是经过了正电荷基团的修饰，又叫特殊尼龙膜。特殊尼龙膜带有正电荷，核酸带有负电荷，因此二者可靠静电吸引牢固结合。因此尼龙膜对核酸的结合力要比硝酸纤维素膜强好多倍。特别是经短波紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联，从而使结合更加牢固。因此特别适用于小分子核酸片段的杂交。另外碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上，因此使DNA的变性、吸附和固定可一步完成，特别适用于菌落原位印迹法。,尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便，可 进行多次重复杂交。另外，在低离子强度条件下，也可与核酸牢固结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较多，杂交信号本底较高，应注意封闭。, 印迹方法,转移方法不同，可分为 斑点或狭缝印迹，即直接将核酸样品点样于固相支持物上； 虹吸印迹法，利用毛细管虹吸作用，由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上； 电转印迹法，即利用电场力的作用将核酸带到固相支持物上； 真空转移法，即利用真空抽滤作用，将核酸分子带到固相支持物上。,根据要转印核酸品种的不同，又可分为 Southern印迹法：是指将电泳分离的DNA从 凝胶中转移到固相支持物上的过程。 Northern印迹法：是指RNA的印迹过程。,步骤： a.DNA分子经限制内切酶酶切。酶切变成合适长度的DNA片段（根据实验目的而定，突变检测则短，定性定量则长）。一般理想的是0.510Kb，因片段大小直接影响转移效率。 b.在琼脂糖凝胶中进行电泳。分离DNA片段，经EB（溴化乙锭）染色后观察DNA片段大小，并与DNA分子量标准参照物比较（Marker）。记录或照像各DNA片段位置。尤其留意我们所感兴趣的DNA片段。 （琼脂糖电泳常用于核酸，一般为水平板电泳 SDS电泳常用于蛋白质，一般为垂直板电泳）,Southern印迹法,c.将凝胶浸泡于适量的变性液中(1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前，用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min，脱嘌呤后，再进行碱变性处理，使之降解为小片段，因为片段的大小直接影响转移速率。小于15Kb，转移1h，大于15Kb则需要18h。 d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法和真空印迹法。其中常用的是后两种，本教研室常用后一种，真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将DNA从凝胶转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、尼龙膜）。 e.固定，上一步骤虽然将DNA转移到固相支持物上，但结合还不牢固，需进一步固定。方法有：对于硝酸纤维膜，可真空下80烘烤2h(亦可无真空)，对尼龙膜还可用短波紫外线（波长254nm）照射几分钟进行固定，固定后方可进行下一步的杂交。,Northern印迹法是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。从而可用于杂交反应以鉴定其中特定mRNA的丰度。 基本原理与Southern印迹相同，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，因为碱导致RNA水解。RNA的变性常与电泳同时进行，常有3种方法，即聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳；甲醛变性凝胶电泳和甲基氧化汞电泳，常用的是第二种。,Northern印迹法,RNA经变性电泳后，一般可进行转移（印迹），其印迹方法与Southern方法相同。但对含甲醛的凝胶，可用DEPC预处理水漂洗，以去除甲醛。如果凝胶较浓（大于1）、较厚（如大于0.5cm）或待测RNA片段较大（大于2.5kb），可预先将凝胶放在0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分钟，以便充分使RNA变性。然后DEPC处理过的水漂洗，最后用20SSC浸泡45min。 固定方法，常用真空烘烤（80）2h。,2杂交（固液相杂交）技术,DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性和具有 同源序列的两条单链的复性过程。RNA分子杂交也涉 及变性和复性过程（这种变性是单链RNA分子内部发 夹结构打开过程），其基本原理和方法与DNA杂交基 本一致。因此以DNA分子杂交为例进行介绍。,（1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成单链DNA的过程。 变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性 碱变性等 常用方法是加热变性和碱变性。 DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称 增色效应。当增色效应达到最大值的50%时温度，称熔解温度 （melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的 DNA双链已解离为单链，也就是说，Tm值反映了DNA变性的程度 和难易，Tm值越大，变性越难，反之，变性容易。,大多数DNA的Tm值在8590左右。但Tm值并不是一个固定常数，常受许多因素影响。 DNA的碱基组成。A：T碱基对只有两个氢链，而G：C碱基对有3个氢键。因此Tm值主要受G：C碱基对数量多少的影响，有一个经验公式为： Tm(G+C)%0.4169.3 溶液的离子强度。DNA链上的磷酸基团带负电荷，它们之间的静电具有相互排斥作用，可导致DNA双链结构的不稳定，比如：在无盐的水中，DNA在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链的稳定性增加，Tm值亦会升高。,pH值，pH值在59之间范围内，Tm值变化不明 显，即DNA双链比较稳定，在高pH值情况下，可使碱基 失去形成氢键的能力。当pH值大于11.3时，所有氢键 均被破坏，DNA完全变性。这就是碱变性的原理。 变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形 成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。 通常用50的甲酰胺可以使Tm值降低30。,（2）复性 变性DNA的两条互补单链，或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火。 复性并不是变性反应的一个简单逆反应过程。复性的过程是相当复杂的。变性过程可以在一个极短的时间内完成（几秒钟），而复性则需要相对较长的时间才能完成。复性的时间与碰撞机率或有效配对有关。分子碰撞机率越大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，只有正确配对才是复性的开始。如果使热变性的DNA溶液迅速冷却，则只能形成一些不规则的碱基对，而不会完全恢复DNA双链结构。要想使变性DNA完全恢复天然的双链结构，则要在低于Tm值25的温度下维持相当长的时间才能完成。,复性的（速度）过程要受到许多因素的影响。 DNA的浓度：DNA浓度直接影响到DNA单链间碰撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。 DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很难形成正确配对，因此复性速度较慢；但一旦复性，又难于变性。 温度：温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；而温度过低，碰撞机率减少，一旦形成局部错误配对，又不易解离，难以继续寻找正确配对，因而使复性速度降低；适宜的温度是较Tm值低1525。,离子强度：离子强度过低，不利于复性。 pH值：pH值在59范围内，不影响复性速度，过低或过高则影响。 DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。,（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素 DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越快。其方 法有：加入足够的DNA；尽量减少杂交的体积，一般 以每平方厘米滤膜面积加50100l杂交液为宜。 DNA探针的长度：在杂交过程中，待测DNA固定 在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越 慢，变性越慢。因此探针的长度不宜过长，一般以1050bp（一般探针20bp）。,离子强度：离子强度对变性影响较大。一般常用5或6SSC（1SSC为0.15mol/L Nacl和0.015mol柠檬酸钠）。 温度：温度对于杂交（复性）反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素。 一般认为杂交温度为：68（不含甲酰胺（作用：降低Tm值）；当含50甲酰胺时，在42进行杂交。 洗膜温度一般认为5565。 对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据下列公式推算：Tm=4G：C对数量2A：T对数量。而杂交温度一般比Tm值低5，即55。 Tm值的推算：与G：C对数量，离子强度，变性剂等有关。,杂交时间：一般应为CoT1/2的13。 Yz Yz 小时/Cot1/2 510X 510X Co单链DNA浓度，t1/2反应一半时的时间，Y为探针DNA的复杂性，即片段大小（Kb），Z为杂交体系的体积(ml)。经验杂交时间816h，过夜。,减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。采用鲑鱼精子DNA（Salmon Sperm DNA）或小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA）封闭DNA非特异位点；采用Dehardt氏液（含聚蔗糖400，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），除封闭DNA非特异位点外，更主要封闭膜上非特异吸附位点。近年来采用脱脂奶粉代替Denhardt氏液。 促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促进DNA链间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应，促进杂交反应速度。如10硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10100倍。,预杂交；将膜放在预杂液中，即不放探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂交位点。预杂交的温度和时间一般与杂交的温度和时间是一样的。 预杂交液：5SSC； 5 Denhardt；50mmol/L PBS； 0.2%SDS；500ug变性鲑鱼精DNA；50%甲酰胺 杂交：杂交液中除含封闭物质外，还含有10硫酸葡聚糖和探针。探针如果是双链DNA，则需要进行变性处理：沸水中加热5min，然后迅速置冰浴中（防止蛋白酶作用）；也可用碱变性处理。探针是寡核苷酸片段、单链DNA或RNA，则不需要进行变性处理。,（4）杂交操作步骤,将探针加到杂交液中，然后与膜上的待测核酸进行杂交反应。温度68（不含甲酰胺），42（含50甲酰胺），杂交时间：816h过夜。 洗液：洗膜过程是将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定的温度下，非特异杂交体容易解链而被洗掉，而特异性杂交体由于稳定