石蜡切片组织RNA提取.ppt

从石蜡切片组织中提取RNA,董进曲/ Jinqu Dong 2013.12.26,概览,有关石蜡切片,石蜡切片（paraffin section）： 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。,有关石蜡切片,石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。,Ambion1975,石蜡组织切片RNA提取：实验原理,二甲苯&Ambion1975试剂盒：,蛋白酶K：消化与RNA结合的组蛋白,关键点：,二甲苯：溶解并去除石蜡,通过二甲苯的去蜡以及蛋白酶K使RNA从石蜡组织中裂解释放，并通过DNA吸附柱有效提取RNA.,后续分析困难,受破坏RNA（固定步骤）,降低RNA 得率,注：RNA降解,内容,1、样品处理 2、RNA抽提,样品处理,存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间） 实验室信息管理系统 Microsoft Excel 手写记录,RNA提取前,1.1 实验前的准备工作 1.1.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风10min。 1.1.2 在第一次使用Wash1和Wash2/3之前，按照下列步骤加入无水乙醇：加入42mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash1中，充分混匀，即为工作液；加入48mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash2/3中，充分混匀，即为工作液。 1.1.3 用镊子将刀片蘸取少量酒精，酒精灯上灼烧刀片，冷却后备用。,1.石蜡组织切片收集 及鉴定 2.组织切片刮取 3.去除石蜡 4.裂解消化DNA 5.消化DNA与收集RNA,石蜡组织切片RNA提取步骤,RNA提取前,1.2 操作步骤 1.2.1 石蜡包埋组织样品的预处理 1.2.1.1. 取石蜡块和一张干净的称量纸，使用冷却后的洁净刀片将组织轻轻刮下来，刮片厚度不大于50m，尽量避免刮下石蜡。 注意： 切取石蜡组织块的时候，组织碎屑越薄越好，并且尽可能少地切取石蜡块。 1.2.1.2. 将刮取的组织小心地转移至干净的1.5ml 离心管中，至总体积约为300 L。 1.2.1.3. 如果样品为石蜡切片，可以直接进行后续的脱蜡处理，但是建议5-20m石蜡卷量不要超过总厚度80m：即5m切片取16片，而20m切片取4片。 注意：如果需要进行miRNA实验，石蜡切片厚度应不低于10m。,3. RNA 抽提,1.2.2 二甲苯脱石蜡 1.2.2.1. 加入1ml 二甲苯，至上述离心管中，盖紧盖子，剧烈震荡混匀5min；瞬时离心，将附着在管壁的组织收集至管底；50，3min，离心机最大转速室温离心2min，弃上清。 注意： 二甲苯有毒，应尽量在通风橱中开盖操作，以减少实验室空气污染。 1.2.2.2. 观察形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复1.2.2.1实验操作。 1.2.2.3. 加入1ml无水乙醇至离心管中，剧烈震荡混匀2min，离心机最大转速（13200rpm)室温离心2min，小心弃上清；重复此步骤一次。,3. RNA 抽提,1.2.2.4. 弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。 1.2.2.5. 真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇（5min)，45，浓缩时间20min；如果室温晾干组织沉淀，时间为15-45 min。 。 1.2.3 蛋白酶消化,3. RNA 抽提,1.2.3.2 加入4L Protease后，上下颠倒混匀，如果组织附着在管壁上，用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里。 1.2.3.3 置于恒温金属浴中孵育，50，500rpm摇动3h；然后70，500rpm摇动20min。 注意：如果延长70反应时间，有可能导致RNA降解，故不要随意延长时间。,3. RNA 抽提,1.2.4 总核酸提取,1.2.4.2 混匀，吸取700L混合液至过滤柱里，为放止堵住过滤柱，避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里，然后10,000g，30s，弃滤液至原管。 1.2.4.3 加700L Wash1至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液。,3. RNA 抽提,1.2.4.4 加500L Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液。 1.2.4.5 空甩，10,000g，30s，去除残留洗液。 1.2.5 DNA酶消化和RNA分离纯化,3. RNA 抽提,1.2.5.2 加入60LDNase mix至每个Filter Cartridge中心，盖上管盖，室温孵育30min。 1.2.5.3 加700L Wash1至Filter Cartridge上，室温孵育30-60s后，10,000g，30s，弃滤液。 1.2.5.4 加500L Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液； 1.2.5.5 重复一次4.2.5.4操作后，10,000g，空甩1min。 1.2.5.6 将Filter Cartridge转入另一新Collection Tube管中，加60L Elution Solution到滤膜中心，盖上管盖室温静置1min后，最大转速1min。 1.2.5.7 进行Nano Drop RNA定量，如果不马上定量，将样品保存于-80。,使用二甲苯脱蜡，去蜡更完全，但二甲苯有毒；,注意事项,观察脱蜡后形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复脱蜡;,真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇,充分干燥影响下一步消化