PCR技术及应用.ppt

分子生物学与临床,目 录,PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 ),基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,94变性,50-65退火,XX延伸,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,4 ）用途广泛,生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,循环仪,94 55 72 ,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 57 min,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列,（固定化PCR）,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,荧光标记,荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,SYBR-Green I,Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量,荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET),Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,荧光共振能量传递（FRET Probe）,双标记探针（Taqman Probe）