胚胎冻融原理及技术进展.ppt

胚胎冻融原理及技术进展,一、冷冻胚胎概念,采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎在-196的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存技术。,二、冷冻胚胎适应症,移植当日母体数据不达标，不适合移植； 有多余胚胎。,缺点：冻胚复苏有可能导致降级或损失。,三、胚胎的选择,原核期胚胎 原核期时间短； 细胞较大，对冷冻技求高； 对原核期胚胎的发育潜能判断难度大。,卵裂期胚胎：-级,囊胚期胚胎：3CC 以上可利用囊胚。,囊胚冷冻优势: 囊胚期表面积与体积比大，对脱水复水造成的体积变化耐受性好； 囊胚期细胞数多，损伤后修复能力强，少数细胞死亡后对胚胎发育能力影响小。,卵裂期胚胎与囊胚期胚胎冷冻复苏移植,临床妊娠率没有统计学差异； 囊胚期胚胎冷冻复苏移植的胚胎种植率优于卵裂期胚胎冷冻复苏移植，流产率要高于卵裂期胚胎冷冻复苏移植。 Zeng M, Su S, Li L. e: a meta-analysis.J Assist Reprod Genet. 2018, 35(1):127-134.,四、 慢速冷冻及解冻技术,依靠冷冻保护剂，慢速降温速率以及置冰来减少和避免细胞内冰结晶的形成，以及渗透压变化和温度变化对胚胎的打击。 可用于胚胎发育的各个阶段，如受精卵、分裂期和囊胚期的胚胎。,1. 仪器及试剂,生物冷冻仪，麦管 试剂：PROH，PROH+Sucrose，glycerol,2. 分裂期细胞慢速冷冻流程,3. 分裂期细胞解冻流程,4. 囊胚期细胞慢速冷冻流程,5. 囊胚期细胞解冻流程,6. 慢速冷冻缺点,冷冻操作时间长； 需高度精确的程序化冷冻仪。,五、玻璃化冷冻技术,玻璃化冷冻：通过高浓度的冷冻保护剂在一定的降温速率下，由液相直接转变成为一种玻璃状的固体状态的过程。,1. 冷冻载体和试剂,冷冻载体：冷冻载杆(Cryotop)、冷冻薄膜( cryotop)、冷冻环(Cryoloop)、冷冻叶片(cryoleaf)、拉细麦管(Open pulled straw)等。 玻璃化试剂： 基本操作液BS：Modified HTF+20%血清蛋白替代物（SPS） 预平衡液ES：以BS为基础液配制7.5%DMSO+7.5%EG 玻璃化冷冻液VS：以BS为基础液配制15%DMSO+15%EG+0.5MSucrose,2.从原核到囊胚阶段胚胎的玻璃化冷冻,ES,VS1,VS2,预平衡 玻璃化,囊胚冷冻前进行人工皱缩( 对滋养细胞层进行激光穿刺，使囊胚腔内液体流出，囊胚腔 塌陷，再进行冷冻减少冰晶的产生) 后再行冷冻。,3. 玻璃化冷冻胚胎的复温,清洗液(WS)：mHTF+20%SPS； 复温液(TS)：以WS为基础液配制1.0mol/L的蔗糖液； 复苏液(DS)：以WS为基础液配制0.5mol/L的蔗糖液。,4. 玻璃化冷冻的优缺点,降温速度快(50020 000/min)，无冰晶形成； 耗时较短； 无需昂贵仪器； 复苏后存活率高。,保护剂毒性。 开放载体：交叉污染。 对细胞超微结构的影响：玻璃化冷冻时巨大的渗透压变化及高浓度冷冻保护剂会引起滋养细胞微绒毛数量的减少，对质膜、线粒体和粗面内质网等细胞器都可能造成影响。 操作机械性损伤：人为技术熟练程度；激光辅助也可能会因其热效应而影响胚胎发育。,六、胚胎解冻,卵裂期胚胎存活标准：解冻2h 后有 50%细胞完好透亮。 囊胚解冻存活标准：解冻培养后囊胚重新扩张到具有正常内细胞团和滋养外胚层形态。,影响冻融胚胎存活的因素,胚胎质量 冷冻保护剂 冷冻载体 冻融方法,玻璃化冷冻胚胎比程序化冷冻胚胎能获得更高的冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率。 Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R, et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce