食品生物技术导论基因工程

1,第二章 食品与基因工程 Food and Gene Engineering,基因工程是生物工程的核心技术，是最具生命力和最引人注目的前沿学科之一。,教学目标,1、了解基因工程的产生及发展 2、掌握基因工程的概念和特点 3、掌握基因工程的四大要素 4、掌握基因工程的原理和过程 5、了解基因工程在食品工业中的应用,第一节 基因工程概述,一、基因及其发展简史,二、基因工程涵义,三、基因工程的一般步骤,4,1、基因概念,基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列。 指导人体内重要物质蛋白质等的合成，维持着人体的正常生理功能。如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，就可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。,基因是基因工程的操作对象,5,基因（gene）生命的最大奥秘,物质层面：是染色体上一段脱氧核糖核酸 （DNA）序列。 功能层面：是遗传信息的载体，编码蛋白质和核糖核酸（RNA）分子功能，调控基因表达。,6,DNA结构,戊糖,磷酸,单核苷酸,碱基,脱氧核糖和磷酸基通过3,5磷酸二酯键连接形成螺旋链的骨架,7,3端,3端,5端,5端,磷酸二酯键,碱基处于螺旋的内侧,9,1865 孟德尔的豌豆实验,发现了遗传规律： 同对因子分离 异对因子自由组合 首次提出了“遗传因子”（即基因）,现代遗传学之父，奥地利生物学家格雷戈尔孟德尔,2、基因发展简史,10,1915年至1928年摩尔根的果蝇实验,进一步证实了孟德尔因子和孟德尔定律 两大重要发现： 基因是在染色体上， 遗传的基因链锁和互换定律。 即建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。,美国遗传学家摩尔根,11,1953年最伟大的模型 DNA双螺旋结构模型,提出的DNA右手双螺旋结构，在英国自然杂志上发表了论文并1962年获得诺贝尔奖。 提出了DNA的复制机制即半保留复制。,美国生物化学家沃森（左一） 英国生物物理学家克里克 ( 左二）,从分子水平揭示了种瓜得瓜，种豆得豆的遗传机理,DNA半保留复制,DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。,二、基因工程涵义,14,1、基因工程诞生的基础,（1）理论上的三大发现 20世纪40年代确定的遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质（肺炎双球菌转化实验） 50年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。 50年代末60年代：中心法则操纵子学说及遗传密码的破译。,15,16,中心法则描述的是遗传信息传递表达路径的原理。,17,（2）基因工程研究的理论依据 基因可以重组互换 基因可切割 基因可转移 遗传密码是通用的 多肽与基因之间存在对应关系 基因可通过复制把遗传信息传递给下一代,18,（3）技术上的三大发明 60年代末70年代：DNA分子的体外切割与连接技术。 70年代：基因工程载体的使用。 70年代： DNA分子的序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂交技术等。 1973年Cohen等体外构建细菌质粒的成功标志着基因工程诞生，这年定为基因工程诞生元年。,2、基因工程概念(Gene engineering),指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。,工具酶,目的或靶基因 ( 源自供体 ),受 体,载 体,最终目的,20,3、基因工程的主要内容,从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,三、基因工程的一般步骤,22,1、基因工程基本技术路线,2、基因操作的基本步骤,载 体,供体,目的 基因,受 体,工具酶,24,即基因工程是基因的一种操作平台与技术 基因工程五大基本操作单元： 切、接、转、增、检,DNA的体外重组,转化子的筛选与鉴定,某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供可能,可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中,重组DNA分子的转化与扩增,25,工具酶 目的基因（制备） 基因载体 基因受体,基因工程四大要素,第二节 工具酶,基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具,27,一、限制性内切酶 （Restriction endonuclease） 1、概念,指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,28,I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。 II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。 III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。,2、限制性内切酶种类,29,1973年由H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌系编号、菌株名、分离顺序。 （1）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 （2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面。如Ecok, EcoR （3） 同一菌株中有不同的限制性内切酶时，按分离顺序用罗马字母表示，正体书写。如EcoR I，EcoR V。,3、限制性内切酶命名原则,30,例如：流感嗜血菌d株 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d Hind ,31,（1）作用机制 限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段。,4、限制性内切酶作用机制和方式,（2）酶切特点,识别双链DNA分子中48对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的对称回文结构。 EcoR的切割位点 EcoR的识别序列 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5,切割位置,识别结构,识别长度,33,识别序列：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然） 稀切酶：能够识别长序列及富集GC和AT的识别序列（几率小）的内切酶。 同裂酶：识别相同序列的限制酶 同尾酶：识别序列不同，但切割得到的DNA片段具有相同的黏性末端。 各种类型见P18-19,黏性末端：被限制酶交错切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5粘性和3粘性）,（3）切割方式,5-P,3-OH,3-OH,5-P,5-P,5-P,3-OH,3-OH,EcoR,形成具有互补碱基 序列的单链黏性末 端5-GAATTC-3,35,EcoR产生的5粘性末端,5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5,5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C5,37,47,EcoR,36,PstI产生的3粘性末端,5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5,5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G3 3C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C5,37,47,PstI,37,例如：EcoR V 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 其切割后形成5 GAT和ATC 3、 3 CTA和TAG 5。,平整末端：同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端。,反应底物 （DNA） 内切酶用量 （活力决定） 反应缓冲液 （最适pH 7.5） 适当的温度（37）,5、限制性内切核酸酶反应系统,39,反应系统缓冲液,Tris-HCl 50mM pH 7.5 MgCl2 10mM 低盐酶： 050mM NaCl 0150mM 中盐酶：100mM DTT/BSA 1mM 高盐酶：150mM Volume 20100L T,T 37，11.5h 1U核酸内切酶的活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1 g标准DNA所需的酶量。,40,琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动， 不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。 使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。,鉴定凝胶电泳,41,观察:凝胶成像系统,pBI121双酶切大片段的获得 Big fragment obtained from pBI121 after double enzyme digestion,pMD18-T curcin双酶切小片段的获得 Small fragment obtained from pMD18-T curcin after double enzyme digestion,13 kb,酶切片段,46,二、DNA连接酶,1、概念：能催化DNA分子中相邻的3-OH和5-P末端之间形成磷酸二酯键，即可封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。,47,2、主要的两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌-DNA连接酶：只能连接黏性末端 ，需NAD+为辅助因子。（同一种限制酶或两种同尾酶） （2）T4-DNA连接酶：连接黏性末端、平整末端，需ATP为辅助因子。 （同一种或两种限制酶） 作用：DNA重组中促使载体与目的DNA连接（即两种来源的DNA）。（最适温度37，或415）,5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5,37,EcoR,5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C5,P-A-A-T-T-C-X-Y-G-OH OH-G-Y-X-C-T-T-A-A-P,大肠杆菌 连接酶,-X-Y- -Y-X-,载 体,供体,目的 基因,受 体,工具酶,（1）DNA片段末端修饰 核酸外切酶：切成平整末端 末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端 碱性磷酸酶：将5-P修饰成5-OH，防止载体自我环化 （2）DNA片段加连杆后连接 人工合成连杆或衔接头,3、非互补黏性末端、非平整末端的连接,51,三、其他工具酶,DNA聚合酶：PCR扩增 T4多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至5-OH上，作为DNA的 5-末端标记。 S1核酸酶：分析DNA-RNA杂合子结构； 反向转录酶：以RNA为模板，反向转录形成与已知RNA互补的DNA链（构建cDNA文库）。,52,第三节 目的基因的制备,一、生物学方法,二、化学合成法,三、基因文库法,四、PCR扩增法,53,1、目的基因的定义 目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。,2、目的基因的来源 真核生物染色体基因组（人和动物）；原核生 物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。,54,一、生物学方法,工作原理：把染色体DNA用限制内切酶切割，将所有片段链接到某载体上，转入大肠杆菌中增殖。再用适当方法筛选出含目的基因的的重组体菌落，从重组体菌落提取DNA，经酶切后获得目的基因。,55,对象：原核生物基因组较小，基因容易定位 ，或已知核苷酸序列的DNA分子。 优点：快速简便、产物纯度高。,56,二、 化学合成法,如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 通常是先合成一定长度（200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。 然后将寡核苷酸适当连接组装成完整的目的基因,57, 合成引物 合成DNA寡核苷酸连杆 合成基因片断 DNA片断的连接重组，采用DNA片段的连接酶有E.coli DNA 、T4-DNA连接酶,步 骤：,58,工作原理：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 包含某种生物基因组全部基因的受体菌群体称为该生物的基因组文库。,三、基因文库法,抽提基因组DNA,制备DNA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌体,筛选目的基因 （核酸探针法、免疫结合法）,基因文库构建流程图, 噬菌体、plasmid、YAC等,每个细菌内都携带一种 重组DNA分子的多个拷 贝。全部细菌所携带的 各种染色体DNA片段就 涵盖了基因组全部信 息，即基因文库。,60,构建基因library,+ ligase,61,A plasmid library,62,四、PCR扩增法（聚合酶链式反应） Polymerase chain reaction,PCR技术是基因扩增技术的一次重大革新； 1985年美国PE-Cetus 公司的Millis等研制，于1993年获诺贝尔化学奖。 PCR技术是指模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列合成及扩增的技术。 前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。,PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,解旋酶双链变单链,DNA聚合酶使链延伸,引物,DNA的天然复制,64,1、PCR原理,PCR技术的实质为体内DNA复制的体外模拟。 即使双链DNA热变性而分开成为单链DNA，退火后在低温下，两个与模板互补的引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何指数增长。,65,PCR技术原理,模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 55C,在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA 94C,从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链 72C,变性,退火,延伸,PCR技术原理示意图,循环1,67,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,68,2、PCR反应过程,69, 模板DNA的变性：模板DNA加热至9495一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,2、PCR反应步骤,引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环“变性-退火-延伸”过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,71,PCR扩增仪,72,3、PCR反应体系,反应缓冲液 18（l） dNTP（原料基质，由四种三磷酸脱氧核苷酸 即dATP、dGTP、dTTP、dCTP组成） 2 Primer1（引物） 0.5 Primer2（引物） 0.5 DNA分子（模板） 1 Mg2+（酶的辅助因子，10buffer） 2.5 Taq酶（DNA聚合酶） 0.5,73,4、PCR的特点,灵敏度高PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。 特异性强引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 简便、快速、重复性好一次性加好反应液，24小时完成扩增。 对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 。,第四节 基因克隆载体,一、质粒,二、噬菌体,三、其他,基因载体的概念,将外源DNA或目的基因带入适当宿主细胞（host cell）的工具或运载体。,本身是一个复制子，能自我复制； 相对分子质量较小，限制性内切酶切点少，宜于接受目的基因； 能给宿主细胞（受体）提供可选择标记， 有可供辨认的表形特征，便于筛选； 只有单一限制性内切酶切点，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。,以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞,利于载体制备,载体应具备的条件：,提高外源基因的装载量,77,一、质粒,质粒（plasmid）是寓于宿主细胞中染色体外的遗传因子，是双螺旋闭环的DNA分子。独立于染色体之外进行复制和遗传，又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录， 相对分子量100010000ku。 广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。,78,染色体和质粒的区别与联系,染色体与质粒均与生物遗传有关。 二者都带有能转录并能表达为蛋白质的基因，染色体是生物信息的携带者，其带有大量遗传信息，而质粒则是携带一些表达有特殊功能的蛋白质的基因，有些是对生物绝对需要的。 染色体与质粒化学本质不同：染色体的化学本质是由蛋白质和DNA组成的，质粒是DNA，只有质粒可以作为运载体，染色体不可以。,质粒载体的一般特征,染色体DNA,质粒DNA,大肠杆菌细胞,80,1、质粒类型,严紧型质粒：处于“严紧控制”之下，即其复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。,松弛型质粒：处于“松弛控制”之下，每个细菌中可以有10200份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份，如pBR322。 宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。,2、质粒DNA的提取,选择性抽提法：在较温和的条件下，用溶菌酶溶菌，形成的细胞碎片因染色体DNA和质粒DNA有相对分子量上的差异，用高速离心方法分离。相对分子量较小的质粒DNA留于上清液，经乙醇沉淀得到质粒DNA粗制品。 碱性SDS法：在pH12.012.5范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的DNA沉淀，再经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。,碱性SDS法提取质粒DNA的步骤,收集细胞,加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）,加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS),加入溶液III (3M NaAc pH4.8),离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液,苯酚抽提去除蛋白质,乙醇沉淀收集质粒DNA,在强碱性环境中暴露时间过长，cDNA可发生不可逆变性,84,3、质粒DNA的纯化,碱性蔗糖密度梯度离心法：染色体双螺旋开链DNA易变性，而闭环双链质粒DNA不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性DNA而分离纯化。 氯化铯-溴化乙锭（Et-Br）密度梯度离心法：染色体双螺旋开链DNA易和染料Et-Br结合而密度降低，质粒DNA由于紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。 硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附单链DNA，染色体DNA易变性形成单链，而与质粒DNA分离。,85,删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量（一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞）。 加入新的遗传标记基因： 引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列：即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)。,4、质粒的改造构建,常用质粒载体：,（1） 大 肠 杆 菌 质 粒 载 体,Ampr,Tet r,识别位点,pBR322 （4363bp）,pBR322（含两个抗生素抗性基因）,抗氨苄青霉素,抗四环素,复制起始点,pUC18/19,加入,lacZ蓝-白斑筛选： 具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译LacZ基因编码半乳糖苷酶，该酶能水解生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。,（2）穿梭质粒载体（shuttle vector）,指能在两种不同生物中复制的质粒载体。如有的质粒载体除了含大肠杆菌源质粒的ori外，还含有蓝藻源质粒的ori，是这两种生物的穿梭质粒载体；还有的能在原核生物（如E.coli）、真核细胞（如酵母）中复制。 含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体（shuttle vectors）。,二、噬菌体,噬菌体（phage）是病毒的一种，没有细胞结构，由核酸和蛋白质构成。因其缺乏代谢的酶体系，不能脱离宿主细胞而自行繁殖，只能在活体细胞中生长并对宿主细胞有严格专一性。可作为基因载体的主要是噬菌体。 研究始于上世纪50年代，1974年Davis发现噬菌体失去20%的DNA仍不失活，认为此缺失部分可装载其他DNA，至今已构建100多种。,噬菌体的主要类型：,插入型载体（insertion vector）：为噬菌体基因组中缺失部分非必要基因，只含1个可供外源DNA插入的限制性内切酶位点。如charon6单切点是EcoRI。 替换型载体（replacement vector）：在噬菌体的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右臂分开，由外源DNA代替。,92,三、其他载体,M13 噬菌体：环状单链DNA 病毒：SV40、EBV等。,93,第五节 基因重组,基因重组：指将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。 重组方式：以黏性末端连接法为主 直接黏接：简单、效率高 加尾黏接：利用末端核苷酸转移酶在DNA末端制造黏性末端。 主要工具酶：T4-DNA连接酶（5-P和3-OH）,94,重组率,重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 75%,95,5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5,37,EcoR,5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C5,P-A-A-T-T-C-X-Y-G-OH OH-G-Y-X-C-T-T-A-A-P,大肠杆菌 连接酶,-X-Y- -Y-X-,96,第六节 基因的转化与表达,一、目的DNA的导入,二、扩增检筛,三、目的基因表达,97,一、目的基因导入受体细胞,1、宿主细胞（受体细胞） （1）概念： 指在转化、转导和杂交中接受外源基因DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。,98,原核生物细胞：如大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、蓝藻、农杆菌等； 真核生物细胞：主要是酵母 特点：单细胞；非致病菌，安全；,（2）宿主细胞类型：,2、感受态,感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效作为转化受体的某些生理状态。取决于受体细胞自身的生理状态及重组DNA分子的构型和分子大小，一般宿主细胞在对数生长期转化能力最强。 感受态细胞：能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。,100,3、转化,根据选用的载体系统和受体细胞类型而定： 用于微生物细胞基因导入的有直接转化法、化合物诱导转化法、接合转化法、电穿孔转化法等； 用于植物细胞基因导入的有微弹轰击转化法、激光微束穿孔转化法等。,101,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 转化率：每微克重组DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不生长）。,电穿孔转化,102,二、扩增检筛,1、扩增 将目的基因与载体切割后连接成重组子（重组DNA）后导入细菌细胞中，转化后的转化子（菌落）被置于含有标记抗菌素的丰富培养基上生长，细菌转化繁殖后即完成目的基因的扩增。,便于筛选、鉴定,103,2、筛选,方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。,104, 根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选: Ampr （抗氨苄青霉素） Tetr （抗四环素）,pBR322 4363bp,ori,识别位点,Ampr,Tet r,105,106, 利用乳糖操纵子lacZ基因（蓝白斑）筛选：,具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译LacZ基因编码半乳糖苷酶，该酶能水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。,107,DNA芯片：将许多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段（探针）固定在芯片的每个预先设置的区域，将待测样本标记后，利用碱基互补配对的原理同芯片进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，可同时检测成千上万个基因。, 应用DNA芯片鉴定重组子,108,蛋白质凝胶电泳：PAGE 免疫检测法： 酶联免疫吸附法（ELISA）; 蛋白质印迹法（Western Bloting）； 免疫沉淀法； 固相放射性免疫测定法（RIA）。, 根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）筛选（无标记基因或无法合成探针时）,109,三、目的基因的表达,基因表达：指使特异基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（酶），获得其代谢产物的过程。 目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序，则该目的基因就可以表达，从而使基因工程得以实现。,1、来自PCR产物（染色体DNA、RNA提取） 2、文库筛选（染DNA、RNA）,新产品、产物,目的基因,克隆载体,连接,重组DNA分子,细菌中原核表达,在植物中表达(转基因植物),在酵母中表达,病毒中表达,分离纯化,上游技术,下游技术,酶切,酶切,转化感受态宿主细胞,目的基因被克隆,构建其表达载体,转化感受态宿主细胞,PCR和酶切鉴定,Southern Northern Western 鉴定,第七节 基因工程在食品工业中的应用,一、转基因微生物食品,二、转基因动物食品,三、转基因植物食品,112,转基因食品 （ Genetically Modified Food，GMF）,转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。 主要指用作食品的转基因植物 类型：增产型；控熟型；高营养型； 保健型；加工型；新品种型,113,一、转基因微生物食品,1、定义： 指由转基因微生物产生的食品；或利用转基因微生物为原（辅）料上产加工的食品、食品添加剂；或以使用转基因微生物制造的农药、肥料、饲料的动、植物所产生的食品。 该转基因微生物称为工程菌。,114,2、特点,除转基因益生菌培养增殖后作为发酵食品成分直接食用外，转基因微生物一般不作为食品主要成分，而是作为食品加工的辅料成分，如酶制剂； 以使用转基因微生物产生的农药、肥料、饲料生产的食品为间接的转基因食品。 安全性高。,115,3、转基因微生物食品的应用,（1）提高食品产品的品质 （2）简化生产工艺，缩短生产周期 （3）食品的抗菌和防腐保鲜 （4）食品级酶制剂生产菌的改良 （5）保健食品功效成分的生产 （6）食品微生物的快速检测,116,（1） 提高食品产品的品质,面包酵母的改造应用最早成功应用的工程菌： 导入具有优良特性的酶基因使麦芽透性酶及麦芽糖酶含量显著提高，大大改善面包品质。 酿酒酵母的改造应用： 导入异源-乙酰乳酸脱羧酶去除-乙酰乳酸酶，减少或控制影响啤酒风味的双乙酰含量； 导入硫酸盐代谢途径中的MET25基因，降低影响啤酒风味的硫化氢含量。 ,117,（2）简化生产工艺，缩短生产周期,啤酒酵母的改造应用： 导入大麦芽中的 -葡聚糖酶基因解决啤酒酵母不能分解利用大分子葡聚糖和糊精等物质，改善啤酒发酵液的沉淀性； 导入大麦芽中的-淀粉酶基因使酵母便可直接利用淀粉进行发酵，无需依赖麦芽生产-淀粉酶的过程，可缩短生产流程，简化工序，推动啤酒生产的技术革新。,118,（3）食品的抗菌和防腐保鲜,乳酸菌遗传特性的改造应用： 抗药基因 风味物质基因 产酶基因 耐氧基因 产细菌素基因,P35-36。,119,抗药基因,目前，利用乳酸菌发酵得到的产品很多，如酸奶、干酪、酸奶油、酸乳酒等，已应用的乳酸菌基本上为野生菌株。 有的野生菌株本身就抗多种抗生素，因而在其使用过程中，抗药基因将有可能以结合、转导和转化等形式在微生物菌群之间相互传递而发生扩散。 利用基因工程技术可选育无耐药基因的菌株，当然也可去除生产中已应用菌株中含有的耐药质粒，从而保证食品用乳酸菌和活菌制剂中菌株的安全性。,120,风味物质基因,乳酸菌发酵产物中与风味有关的物质主要有乳酸、乙醛、丁二酮、3-羟基-2-丁酮、丙酮和丁酮等。可以通过基因工程选育风味物质含量高的乳酸菌菌株。,121,产酶基因,乳酸菌不仅具有一般微生物所产生的酶系，而且还可以产生一些特殊的酶系，如产生有机酸的酶系、合成多糖的酶系、降低胆固醇的酶系、控制内毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各种维生素的酶系和分解胆酸的酶系等，从而赋予乳酸菌特殊的生理功能。 若通过基因工程克隆这些酶系，然后导入到生产干酪、酸奶等发酵乳制品生产用乳酸菌菌株中，将会促进和加速这些产品的成熟。另外，把胆固醇氧化酶基因转到乳酸杆菌中，可降低乳中胆固醇含量。,122,耐氧相关基因,乳酸菌大多数属于厌氧菌，这给实验和生产带来诸多不便。从遗传学和生化角度看，厌氧菌或兼性厌氧菌几乎没有超氧化物歧化酶基因和过氧化氢酶基因或者说其活性很小。若通过生物工程改变超氧化物歧化酶的调控基因则有可能提高其耐氧活性。当然将外源SOD基因和过氧化氢酶基因转入厌氧菌中，也可以起到提高厌氧菌和兼性厌氧菌对氧的抵抗能力。,123,产细菌素基因,乳酸菌代谢不仅可以产生有机酸等产物，还可以产生多种抑制性物质如细菌素、CO2等，具有作为食品防腐剂的应用潜力，若通过生物工程技术将细菌素的结构基因克隆到生产用菌株中，不仅可以使不产细菌素的菌株获得产产细菌素的能力，而且为人工合成大量的细菌素提供了可能。,124,（4）食品级酶制剂生产菌的改良,利用基因工程技术不但可以成倍地提高酶的活力，而且还可以将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因工程菌来生产酶。据统计，已有70的工业用酶是用转基因微生物生产的。 转基因微生物生产酶的优点： 产量高、品质均一、稳定性好、价格低等。,凝乳酶的基因改造应用： 凝乳酶是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。1990年美国FDA已批准在干酪生产中使用，目前3/4干酪为转基因产品，大大缓解了凝乳酶供应不足的状况。 耐热-淀粉酶： 溶菌酶： 葡萄糖氧化酶： ,126,（5）保健食品功效成分的生产,维生素C： 采用基因重组构建菌株高表达的单链蛋白2,5-DKG还原酶，加速催化维生素C的前提2-KLG的生成，缩短维生素C 的生产周期。 核黄素（VB2） 超氧化物歧化酶（SOD） 二十二碳六烯酸（DHA） ,127,（6）食品微生物的快速检测,食源性微生物污染的快速检测： 李斯特菌 沙门氏菌 致泻性大肠杆菌 其他致病菌 ,128,二、转基因动物食品,涉及类型： 家畜家禽：牛、猪、羊、兔、鸡等； 水生生物：各种食用鱼类 昆虫：食用家蚕 主要应用： 改变家畜生成速度； 改善乳产品的营养组分，特别针对婴幼儿 通过生物反应器生产人血清蛋白等。,129,为了提高乳牛的产奶量，可将采用基因工程技术生产的牛生长激素(BST)注射到母牛体内，既可达到提高母牛产奶量的目的，又不影响奶的质量。 同样，为了提高猪的瘦肉含量或降低猪脂肪含量，可将采用基因重组技术生产的猪生长激素，注射至猪体内，便可使猪瘦肉型化，有利于改善肉食品质。,130,三、转基因植物食品,定义：由转基因植物产生的食物或利用转基因植物为原料生产的食品或食品添加剂。 主要类型： 大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕 玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉 油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕 棉花种子 番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱,131,1、提高植物性食品氨基酸含量,现在已经从玉米等植物中克隆到了对Lys（赖氨酸）的抑制作用不敏感的DHDPS的基因，在细胞内积累较高含量的Lys。 玉米-phaseolin富含Met（蛋氨酸），将此蛋白基因转入豆科植物，就可以大大提高豆科植物种子贮存蛋白的Met含量。,（一）改善食品原料的品质,132,2、增加食品的甜味,非洲有一种植物叫应乐果，研究人员在其果实中发现了一种叫做应乐果蛋白的蛋白质，咀嚼时比蔗糖大约甜1万倍，而它所含的蛋白质却又不会在新陈代谢中具有与蔗糖相同的作用，这种特性使之成为蔗糖的理想替代品。 此融合蛋白在转基因番茄和莴苣中进行了表达。,133,3、改造油料作物,用基因工程技术可以提高油脂中抗氧化剂的含量。 甲基转移酶是生育酚形成生育酚的关键酶。现已成功从拟芥南中克隆甲基转移酶基因并转导到大豆中，使该大豆在不降低总生育酚的前提下，使生育酚的含量提高80以上。 最易用基因工程方法进行改造的油料作物是油菜，迄今为止，在世界范围内种植的良种油菜有31是转基因品种。,134,4、改良植物食品的蛋白质品质,如秘鲁“国际马铃薯培育中心”培育出一种蛋白质含量与肉类相当的薯类；转移扁豆蛋白基因可获得具有较高贮存蛋白质的转基因向日葵。 山东农业大学将小牛胸腺DNA导入小麦系814527，培育的蛋白质含量高达16.51的小麦变异株。,135,PG在果实成熟过程中合成。利用转基因技术得到的反义PG番茄，可将其贮藏期延长1倍，同时具有抗裂、抗机械损伤、便于运输、抗真菌感染等特点。 目前已经从桃、猕猴桃、苹