实验大肠杆菌的培养与分离.ppt

实验目的:,1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作 2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,一、基础知识： (一)微生物,：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,(二)细菌,1、结构,2、分裂,3、生殖,4、变异类型,5、在基因工程中的应用,细菌的类型,大肠杆菌属于杆状菌,根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。 自养菌: 异养菌: 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,细菌的营养类型,光能自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌,细菌的革兰氏染色,革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。,大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,-培养基,1.定义 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,(三)细菌的培养,2.培养基的五大营养成分：水、无机盐、碳源、氮源、 生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透压的要求,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方：,细菌喜荤，霉菌喜素,大肠杆菌的配方： 酵母提取物 0.5g 蛋白胨 0.5g Nacl 0.5g 琼脂 1g 水 50ml,3.培养基的类型,按物理状态分：固体培养基和液体培养基。,成分区别：是否加琼脂,按功能分：选择培养基和鉴别培养基,按成分分：天然培养基和合成培养基,液体培养基：扩增细菌、工业生产 固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种,选择培养基: 从微生物群中选择具有特定表型的细胞.使之进行繁殖所用的培养基,称为选择培养基.,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 菌落是鉴定菌种的重要依据。,4、 菌落,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,二、 无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,（）消毒定义：,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,是指杀灭病原微生物的方法。,是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽孢、孢子） 的方法,a. 煮沸消毒法: 100煮沸5-6min b. 巴氏消毒法： 70-75 下煮30min或 80 下煮15min c. 化学药剂消毒法: 用75%酒精进行皮肤消毒; 氯气消毒水源；高锰酸钾溶液；次氯酸钠溶液等 ,（3）常用消毒的方法：,a、灼烧灭菌,常用灭菌的方法：,b、干热灭菌： 160-170 下加热1-2h。 c、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15min.,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,思考,1,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作,（一）培养基的配置与灭菌,取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。,LB液体培养基细菌的扩大培养 LB固体培养基细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使杂菌进入,（二）倒平板,灭菌后的培养基在无菌超净台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。,注意事项： 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板 2.灭菌及消毒：无菌超净台用紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作. 4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌 5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.,（三）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37摇床上振荡培养12小时。,注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.,1、划线分离法 在无菌操作台上用接种环取菌种后在固体培养基的平板上连续划线.,（四）大肠杆菌的分离,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液, 但要在培养基的不同位置连续划线多次。每次划线前接种环都要灼烧灭菌。 2.划线首尾不能相接。 3.划线后, 培养皿倒置培养1224h,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（五）大肠杆菌分离后保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。,1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?,(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?,（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。 （2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。 （3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。,3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,5.如果分离的是转基因的大