血栓止血实验室检应用,郭辉.ppt

血栓止血的实验室检查及临床意义,河北医科大学第二医院检验科 郭辉,血管内皮细胞的促凝和抗栓功能,一、血管内皮细胞的结构 二、血管内皮细胞的止血和促凝作用 三 、血管内皮细胞的抗凝（抗栓）功能,二、血管内皮细胞的止血和促凝作用,（一）EC所产生的黏附蛋白和其他蛋白 1EC之间的黏附蛋白及其他在EC表面上的表达蛋白 2胶原 分泌多种胶原（ 型） 3弹性蛋白及微纤维,4. 层素 受体在层素上结合，调节细胞黏附，促进生长和维持细胞生长 5纤维连结蛋白（FN） 6玻璃体连结蛋白（VN）又称S蛋白 7凝血酶敏感蛋白,（二）EC所产生的血管收缩物质-内皮素 （三）EC所产生的聚集和激活血小板的物质 1WF 2血小板活化因子（PAF）是最强的血小板诱导剂,（四）EC的促凝作用 1产生组织因子 2因子V 由EC合成，也可由肝合成，25%存在血小板颗粒中，75%存在于血浆中。 3F IX及X EC能结合激活的和 4F EC通过裂解蛋白激活F ,5F 维生素A能使EC的F 明显增强 6HMWK 结合在EC上的意义可使PK、F 、F在局部聚集和激活 7Fg和FIB 8EC抑制纤溶 9EC与白细胞相互作用,三 血管内皮细胞的抗凝（抗栓）功能,（一）生成释放使血管松弛的物质 1前列腺环素（PGI2） 2内皮衍生松弛因子,（二）生成和释放抑制血小板黏附和聚集物质 （三）生成抗凝血酶物质 1粘多糖类 2AT- 3血栓调节蛋白（TM）,（四）促进纤溶功能 1t-PA 2u-PA,血 小 板,一 血小板表面结构：细胞外衣和细胞膜 二 血小板的溶胶凝胶区：微管、微丝和膜下细丝、血小板骨架蛋白 微蛋白、肌动蛋白、外廓蛋白、凝溶蛋白、P235（类似外廓蛋白）、肌动蛋白结合蛋白、-辅助肌动蛋白、结合蛋白、肌球蛋白、重链、轻链、原肌球蛋白、链。,三 血小板的细胞器和内含物,1致密颗粒（颗粒）：ADP、ATP、5-HT、Ca2+、Anti-AL、焦磷酸盐。 2-颗粒：PF4、-TG、PDGF（促血小板生长因子）、通透因子、趋化因子、TSP、 FN、 Fg、FV、F/WF、白蛋白。 3溶酶体颗粒（颗粒）：酸性水解酶、组织蛋白酶。 4血小板的特殊膜系统 即开放管道系统（OCS）和致密管道系统（DTS）。,四 血小板膜糖蛋白,（一）血小板膜糖蛋白b-IX复合物为血小板的主要糖蛋白25000个GPIb-IX复合物/一个血小板。 （二）血小板GPb/a复合物为血小板膜上最多糖蛋白5万个分子/一个血小板 （三）整合素家族（Integrin）介导细胞黏附功能的受体蛋白。 （四）血小板的各种颗粒膜糖蛋白：-颗粒膜蛋白（GMP-140）又称PADGEM蛋白、P-选择素，CD63。 （五）其他血小板膜蛋白：血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1）。,五 血小板的生理功能,（一）血小板的初期止血功能 1血小板黏附反应GPIb 2血小板聚集反应：依赖于GPIb/a 3血小板的释放反应：弱作用：ADP肾上腺素、血管加压素、5-HT中等作用：TXA2、PAF，强作用：凝血酶、胰酶、胶原、A23187。,（二）血小板的二期止血功能,1血小板具有“内源性凝血因子”。 纤维蛋白原 5-25mg 表面结合的 2-10 mg/ ptc11 参与ADP诱导的血小板聚集 细胞内的 3-7 mg/ ptc11 释放后参与凝血酶诱导的聚集 FV 600mol/血小板 释放后组成FX的受体 F/VWF 10-28u/血小板 释放后参与血小板聚集 F 1.6-6.1 u/ ptc11 参与接触活化反应 F 全血的50% 提供血浆因子亚单位,2血小板膜表面的磷脂促凝活性 双层不对称磷脂层排列。 膜表面磷脂层：鞘磷脂、磷脂酰胆碱（PC）。 膜内侧磷脂层：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰死氨酸(PS)及磷脂酰肌醇(PI),3胶原诱导的凝血活性 与膜结合的血小板因子相关。 4其他促凝活性与止血功能：血小板可通过其表面所带负电荷使F易被PK水解活化：颗粒释放PF4中和肝素保护凝血酶免受肝素破坏。,血 液 凝 固,一 凝血因子 纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)或FI凝血中心蛋白质即凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。大分子糖蛋白由肝细胞合成。除作为FI直接参与凝血外，还有与PGba结合介导血小板聚集、参与动脉粥样硬化、肿瘤血行转移、影响血液黏稠度。2.04.0gL。,凝血酶原（Prothromin）或F在肝内合成属于依赖维生素K的凝血因子（还有.及PC SP）NP150200mgL血浆。其活化后变为有蛋白水解活性的凝血酶。 组织因子(tissue factorTF)又称组织凝血活酶(tisstue thromboplastin) 或组织凝血活酶因子(tisstue thromboplastin factor)即F，是唯一不存在于血浆中的凝血因子，脑肺胎盘丰富，血管内皮及白细胞中也含有大量的组织因子。其作用为F()的辅因子而启动外源性凝血。, 凝血因子V(FV)，也称为易变因子(labile factor)或前加速因子(Proaccelerin)正常血浆中的一种糖蛋白，不稳定，可作为Xa的辅因子，由肝脏合成，也可在巨核细胞和血小板颗粒中。 凝血因子（FVII）也称稳定因子(Stable factor)或血清凝血酶原转化加速因子(SPCA)，血清高于血浆，NP0.52.0mgL。为Vitk依赖因子在肝脏合成，主要是和组织因子形成复合物而激活FX而参与外源性凝血。,凝血因子和vWF因子 血友病(hemophilia)也称FVIII或抗血友病球蛋白、抗血友病因子。FVIII的血浆含量为0.1mgL。为Ixa的辅因子参与对FX的激活。合成部位未定。 凝血因子IX（FIX血友）(hemophilia)或PTC或Chrismas因子。属于维生素K 依赖因子，其作用激活FX。在肝脏合成。,凝血因子X(FX)或Stuare-Prower因子。维生素K依赖因子，肝脏合成，处于内外源凝血途径的共同途径。 凝血因子XI(FXI)或PTA，以酶原形式存在，并与FXIII.PK.HMWK共同参与凝血的接触相。由肝脏合成。血浆NP46mgL.,凝血因子XII(FXII)或Hageman因子。参与内源性凝血接触相。正常以酶原形式存在，同时还可激活纤溶、诱导中性粒细胞聚集和脱颗粒，以增强血管壁通透性。被C1.am.AT抑制，由肝脏合成。 (十一)前激肽释放酶(PK或fletcher因子)为血浆中的糖蛋白。参与内源性凝血、激活纤溶、激肽生成。血浆中NP1.55mgL.,(十二)高分子量激肽源(HMWK)为多功能蛋白可生成激肽。HMWK无蛋白水解活性。其缺乏不导致临床出血。 (十三)凝血因子XIII(FXIII或Fibrin Sta-bilzing Factor)存在于血浆、血小板和单核细胞的一种糖蛋白。FXIII血浆NP25mgL。以酶原形式存在被凝血酶(Ca2+存在下)激活。,二 凝血过程,(一)内源性凝血途径 1.接触相激活 FXII. XI 2.因子IX的激活 FIX 3.因子的激活 FX (二)外源性凝血途径 (三)凝血的共同途径 因子分别被复合物质复合物激活 1.凝血酶的形成 2.纤维蛋白形成和交联 单体 单体聚合 交联,三.纤维蛋白溶解系统,（一） 纤溶系统成分 1纤溶酶原（PLG） 又名血浆素原，在各种活化剂如t-Pau-PA作用下形成纤溶酶,2 纤溶酶,对纤维蛋白原的降解作用 对纤维蛋白的降解作用 分解各种凝血因子.V.VII.X.VIII.XI也可分解血浆蛋白和补体。 其他作用 裂解XIIa为XIIf将谷氨酸纤溶酶原变为赖氨酸纤溶酶原 降解基质蛋白如NF、层素TS激活某些前激素如前胰岛素、人胎盘促乳素 激活某些蛋白前酶如前胶原酶 激活转化生长因子(TGF-) 降解血小板糖蛋白GPIb.GPba和膜上纤维蛋白原及vWF受体 将单链t-PA(sct-PA)、单链u-PA(sct-PA)转变为双链t-PA(sct-PA)、和双链t-PA(sct-PA).,3.组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)又名血管纤溶酶原活化剂(v-PA) 其主要功能将纤溶酶原精 561-缬562处的肽链裂解成形成具有活性的纤溶酶，其次t-PA能与纤维连结蛋白(FN)结合。 4.尿激酶型纤溶酶原活化剂(t-PA)主要来自泌尿生殖器的上皮细胞。 其主要功能同t-PA并有协同作用。,5纤溶酶原活化剂抑制物,(PAI其中以PAI-1 PAI-2为主)， 来自于血管内皮细胞。 PAI-1主要是灭活t-PA. Tcu-PA活性 PAI-与AT-的结构63%具有同源性，与2-抗纤溶酶，PAI-I.Ci抑制物结构同源性，分为43%.41%和39%。主要作用有效的抑制PA。 其他纤溶酶原活化剂抑制物 蛋白C抑制物（PCI）抑制活化蛋白C又称APCI。广谱丝氨酸蛋白酶抑制物，抑制P-C、凝血酶、Fxa . PK. 胰蛋白酶、靡蛋白酶和纤溶酶活化剂(TCU-pa tct-PA,sct-PA)。 蛋白酶连结(抑制)素-1（PN-1）由内皮细胞产生，在凝血酶胶原的激活下释放PN-1，抑制凝血酶活性。,62-纤溶酶抑制物(2-PI)主要功能抑制纤溶酶，也抑制胰蛋白酶，PK及 其他丝氨酸蛋白酶。2-PI与纤维蛋白结合并与纤溶酶形成复合物。 7富（含）组氨酸糖蛋白(HRG)由肝脏产生对纤溶调节有双重性，对凝血与纤原结合阻止纤维蛋白形成并可与激活的血小板结合调节血小板的凝血与纤溶。,8-巨球蛋白(-M)由肝细胞和巨噬细胞产生，是一种糖蛋白。是一种广谱的蛋白酶抑制物，能与PL.tcu-PA.t-PA.PK结合在抑制纤溶中起“二线”的作用。 9 补体T抑制物(Ci-INH)属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族。主要作用是抑制激活补体第一亚成分F XIIIa.FXIa.PK.PL。,抗 凝 机 制,一抗凝血酶-(AT-):为生理性重要抗凝物质，可灭活凝血酶7080%，还可抑制Xa.Ixa.Xia.XIIa以及纤溶物、胰蛋白酶、激肽释放酶。除肝脏外其他脏器如肺、脾、心、肠、脑也有合成AT-III能力，血管内皮细胞和巨核细胞也合成AT-III.AT-III抗原正常血浆水平为80300mgL，活性为70%130%。 AT-III缺乏是发生静脉血栓和肺栓塞常见原因。,二蛋白C系统,1蛋白C(PC)由肝脏合成，依赖维生素K。 PC可被凝血酶、胰蛋白酶、蝰蛇毒及高浓度Va激活。 PC通过蛋白水解灭活Va.VIIIa，需磷脂和Ca PC阻碍FXa与血小板结合。 PC促进纤溶：APC刺激内皮释放t-PA并灭活PAI。 2血栓调节蛋白(TM)与凝血酶结合抑制后者对FV及血小板的激活。,3蛋白S(PS) 单链糖蛋白 肝脏依赖于Vitk，加速apc对Va的灭活，丧失结合Xa的能力，从而中断血液凝固的“瀑布” 与辅体结合C4bP又失去抗凝活性。 遗传性PS缺乏可致血栓性疾病,4APC自血循环中被清除 蛋白C抑制物(PCI):肝素可使其加速。先天性PCI缺乏临床类似于FV. VIII联合缺乏出血严重。 1抗胰蛋白酶(1-AT) 在没有肝素的情况下(1-AT)对APC的抑制作用强于PCI。 5APC耐受（抵抗）(APCresistance)亦称FV Leiden，由于点突变使FV506位精氨酸被谷氨酸置换，而这一位点是FV被APC裂解点之一，FV失去调控，使凝血活性增高易于发生血栓,不仅发生静脉血栓也可发生动脉血栓。,三 组织因子途径抑制物（TEPI）,TFVIIa复合物增强凝血活性1000倍。TEPI针对TFVIIa的主要调节物，TEPI与Xa1:1抑制。,四 其他抗凝物质,1肝素：一种酸性粘多糖，由肠黏膜肥大细胞合成。加速AT-III,HC-II作用。 2肝素辅因子(HC-II)抑制凝血酶，靡蛋白酶，作用相当13AT-III。 3a 2-巨球蛋白(a2-MG), a2-MG与Ci抑制物共同抑制90%PK活力。其中a2-MG占3550%。 41-抗胰蛋白酶(1-AT) 5Ci抑制物：补体脂酶抑制物。能灭活已激活的补体Cir.CIs及内源性FXIIa.XIa和PK对PLt-PA也有灭活作用。 6蛋白酶连结素I(Protease nexin I)抑制血小板的进一步活化或凝血激活。,止凝血疾病的实验室检查,一血管及支撑组织异常所致的出血性疾病的实验室检查 一般项目 毛细血管脆性 血管脆性、通透性 出血时间 血管收缩能力并内皮细胞和血小板反应能力 APC耐量 血管壁合成PGI2能力 PGI2-TXA2平衡状态,血管壁结构 甲皱毛细血管镜 形态数量结构状态及对刺激反应 内镜检查 局部血管及血流状态 病理学检查 显微超微及免疫组化结构,血管内皮功能 vWF测定 a.抗原性 vWF抗原含量 b.多聚体 vWF结构 c.交叉免疫电泳 vWF多聚化程度 d.vWF瑞斯托霉素 vWF功能 辅因子 (VW:RCOF) 抗原 e.TM抗原、活性及分子数 内皮合成TM功能质量 f.6-K-PGFa抗原 内皮合成PGI2能力 g.内皮素测定 内皮合成释放EC能力,二.血小板量与质异常所致出血性疾病实验室检查, 与血小板数量相关的实验室检查 一般项目 毛细血管脆性 血小板数量或质量 出血时间 血块收缩 血小板数量 血小板计数 外周血巨核细胞测定 巨核细胞数量,(二）血小板形态及生成 外周血小板观察 数量形态大小超缩结构 骨髓涂片及病理 数量形态大小超缩结构 血小板平均体积 大小年龄代谢状态 血小板抗体(PAIg) 免疫破坏情况 血小板生存时间 生成及代谢速率,血小板功能的实验室检查,黏附功能 玻球法黏附 血小板黏附功能 玻柱法黏附 血小板黏附功能 聚集功能 常用诱导剂法(胶原ADP、肾上腺素, 5-HT) 特殊诱导剂 （瑞斯托霉素、PAF血小板激活因子、刺参粘多糖 血小板聚集能力,释放功能 释放实验 血小板含量及释放能力 血小板含量5-HT含量 血小板-TG测定 PF4测定 血小板凝血酶敏感蛋白(TSP) 血小板颗粒膜蛋白(GMP-140) 凝血功能 有效性测定, 血小板活化及代谢产物的实验室检查,血栓烷B2(TXB2)的测定 丙二醛(MDA)测定 12羟17碳三烯酸(HHT)与12羟20碳四烯酸(12-HETE) 代谢 AA代谢 白三烯B4(LTB4)测定 血小板环腺苷酸测定(CAMP),血小板膜糖蛋白(GP),测定如GPIb、GPIIb、GPIIIb、GP、GPV、GP140、GPIb-IX复合物、GPIIba 复合物。,三 凝血因子所致出血性疾病实验室检查,凝血第一阶段的实验室检查 内源性：凝血酶原消耗实验(PCT);活化部分凝血活酶时间(ATPP); 凝血活酶生成及纠正; VIII.IX.XI抗原及活性测定;FX 活性测定。 外源性：组织旁路抑制物（主要用于血栓）;FVII活性RVVT活性;FX活性,凝血第二阶段的实验室检查 PT及纠正 FII. V活性及抗原性及凝血酶-抗凝血酶复合物(TIT)，凝血酶原碎片1+2(F1+2)测定； 异常凝血酶原测定,凝血第三阶段的实验室检查 纤维蛋白原定量测定 纤维蛋白原早期降解产物纤维蛋白肽A.B(FPA.B); 异常纤维蛋白原测定;,纤维蛋白（原）单体测定； 血小板-TG含量及释放能力 血小板PF4含量及活化程度 血小板TSP含量及活化程度 血小板活化程度 血小板凝血活性 纤维蛋白原转换率测定 因子XIII及其亚单位活性及抗原性测定, 凝血全过程异常的实验室检查 凝血时间(CT) 复钙时间(RT), 纤溶亢进所致出血性疾病实验室检查 纤溶活性异常的实验室检查 优球蛋白溶解时间 t-PA活性及抗原 PLG测定 纤溶活性及抗原性测定,纤维蛋白（原）降解产物(FDP)检测 凝血酶时间(TT) 3P实验 乙醇胶(EGPT) FDP测定 D-Dimer二聚体测定 纤维蛋白肽B42及B1542的测定,纤溶抑制物异常的实验室检查 PAI活性及抗原测定 a2活性及抗原测定 激肽系统活性异常的实验室检查 PKA(激肽释放酶原活性) PK(激肽释放酶原活性) 组织激肽释放酶测定,四.病理性循环抗凝物质所致出血性疾病实验室检查,生理性：AT-III活性；肝素辅因子II活性测定；蛋白C(PC)及其活性测定；活化蛋白C抗性（耐受）(APCR)测定；蛋白S抗原测定；a2-MG抗原测定；a2-AT测定；血浆肝素测定。 病理性：交叉复钙时间；肝素及肝素样物质测定（TT及甲苯胺三纠正实验、血浆肝素定量实验、蝰蛇毒时间（肝素鉴别实验）；FVIII抗体测定LAC测定；,出血性疾病的诊断,血栓性疾病、易栓症、抗凝溶栓治疗 一 血栓形成的部位和发生率 血栓性栓塞我国40岁以上人群中心梗39.764.010万，脑卒中发生率109.710万。1182脑卒中经CT证实73.5%为脑梗死者。静脉血栓高于动脉血栓为4:1，静脉血栓可发生在下肢、肝脏、盆腔阴道旁组织的静脉中，下肢盆腔占90%，上肢4%，24%为脏器内静脉。,二.血栓的种类 血小板血栓 白色血栓 红色血栓 混合血栓 微血栓 感染性血栓,三.血栓形成的机制 血管因素 血小板因素 白细胞、红细胞因素； 凝血因子因素 抗凝因子因素1:ATIII.HC-II.PC.PS.LAC; 纤溶因素：1.异常纤溶酶原血症2.纤溶酶原活化剂释放缺陷3.纤溶酶原活化物抑制物过多。,四.血栓性疾病的血液学诊断 内皮素I(endothelin- ET-1)检测 凝血酶调节蛋白检测(TM) 血小板激活后标志物检测 凝血因子活性及抗原性测定 血浆抗凝系统检测，尤其是对家族遗传性血栓； 纤维蛋白分子标志物检测 纤溶活性指标检测,五.易栓症 遗传性抗凝血酶-III缺陷症:常染色体显性遗传。主要为静脉血栓形成。 I型为ATIII功能与抗原水平平行下降。 II型为ATIII抗原水平正常，呈现不同的功能缺陷又分为II-RS型、II-HRS型和II-PE型3个亚型。 II-RS型：反应点功能异常：II-HRS型：肝素结合位点功能异常；II-PE型：多分子功能缺陷，包括对凝血酶、FXa的灭活下降，对肝素的亲和力下降等。,遗传性蛋白C缺陷症 为常染色体显性遗传，分为纯合子型和杂合子型。其缺陷多形成静脉血栓。 I型：PC活性含量平行下降； II型：PC含量正常，活性明显低下,遗传性蛋白S缺陷症 为常染色体显性遗传，分为纯合子型和杂合子型。 I型：游离PS含量 总量 活性均下降； II型：游离PS含量，总量正常 活性均下降 III型：游离PS含量，总量正常 活性下降, 活化蛋白C辅因子-II缺陷症 为常染色体显性遗传,即APC抵抗(耐受)不能灭活FVa.VIIIa。 遗传性肝素辅因子-缺陷症 为常染色体显性遗传，多形成静脉血栓。 先天性异常纤溶酶原血症 为常染色体显性遗传，病人年龄较轻，多形成深部静脉血栓，肺栓塞等。,纤溶酶原活化物抑制物过多 为常染色体显性遗传，静脉血栓形成，PAI而t-PA 异常纤维蛋白原血症 为常染色体显性遗传。 家族性富含组氨酸糖蛋白增多症。为常染色体显性遗传，多发生动脉血栓，如心梗、颈动脉血栓、脑梗等。 遗传性高同型半胱氨酸血症 为常染色体隐性遗传，以动脉硬化和动脉血栓为主。,六 抗凝溶栓治疗的实验室检测 临床上常用抗凝药、溶栓药、抗血小板药和去纤药为预防血栓形成（防栓）和溶解已形成的血栓（溶栓）的药物，这些疗法统称为抗栓治疗，药物过量便会造成出血并发症，用量不足则达不到预期效果。因此在应用这些药物的过程中，必须区别不同的情况选择相应的指标作为实验室监测，指导和调整临床合理用药，使药物既能达到防治血栓形成，又不至于引起出血并发症是非常必要的。,七 抗凝治疗 抗凝治疗的目的在于降低凝血因子的血浆浓度或阻止凝血因子的激活，降低血液的凝固性或高凝状态，以预防血栓的形成或阻止血栓的发展。,普通肝素治疗的监测 1血浆肝素浓度 2APTT(活化的部分凝血活酶时间)为正常值1.52.0倍为佳 3.ACT(活化凝血时间)在体外循环和血液透析过程中监测（肝素量较大10U/ml），ACT在480600s为宜，应用硫酸鱼精蛋白可中和至正