基础医学核酸疫苗及免疫研究进展.ppt

Diagram,4,核酸疫苗定义,1,2,3,5,核酸疫苗的发展史,核酸疫苗的作用原理,核酸疫苗的构建,核酸疫苗的优缺点和应用现状,疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。 将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二代疫苗。 理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而生。,基因疫苗被称为第三代疫苗。,1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。 1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核酸疫苗，证实核酸注射不但能在体内表达抗原蛋白，还可以诱导具有显著保护作用的免疫应答。 因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。,关于核酸免疫的国际会议,1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。WHO主办。主题：核酸疫苗。 1995年2月16-17日，美国马里兰州，Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗和核酸疫苗战略。 1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。 1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗预防传染性疾病和控制核酸疫苗。,定义,核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。,基因疫苗的构建,基因疫苗构建的基本途径,基因疫苗的构建,一、构建基因疫苗的载体 载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工具。 1.载体的分类 按照载体功能可分为克隆载体和表达载体； 按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和病毒载体等。 2.常用于构建基因疫苗的载体 pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、 pcDNA4、 pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、 pRc/RSV 、 pRc/CMV2等多种,基因疫苗的构建,二、基因疫苗的构建方法 1.抗原基因和载体的制备 获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成,基因疫苗的构建,基因表达载体的组成：,复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,为了保证抗原基因的定向正确插入，只有以正确的方向插入表达载体读框启动子下游才能表达抗原基因，故抗原基因两端应具有不同的酶切位点，在设计时须注意这点。,2.抗原基因与载体的连接,连接的方式可分为粘性末端连接和平末端连接两种，其中前者连接效率较高，使用比较多。连接反应时应考虑反应体积、抗原基因与载体的比例、温度和时间和酶量。,粘性末端连接,用同一种或两种 限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,本法适用于在质粒和目的基 因上有相同单或双酶切位点,平末端连接,质粒,产生平末端的 内切酶,DNA连接酶,产生粘性末端 的内切酶,核酸酶S1,目的基因,重组质粒,产生粘性末端 的内切酶,核酸酶S1,本法适用于在质粒 和目的基因上没有 相同的酶切位点！,基因疫苗的构建,3.重组质粒转化受体菌 转化：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 转染：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态称为感受态。其原理是细菌处于0、低渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短暂的热激（42 ）处理后，外源基因容易进入细菌细胞内。 常用的方法为氯化钙共沉淀法和电穿孔法。,基因疫苗的构建,4.重组质粒的筛选与鉴定 一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行 （1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。 （2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴定。 （3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动测序仪测序,基因疫苗的构建,三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测 1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导等方法都可以用来将外源质粒导入真核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最常用的方法。 2.抗原基因在真核细胞中表达的检测 （1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达蛋白；Western印迹检测；酶联免疫吸附测定。 （2）核酸水平的检测：RNA印迹；RT-PCR检测。,由于这个过程实际上是相当复杂的，所以人们对一些具体的细节并不清楚。下面通过对基因疫苗经过肌肉组织和黏膜免疫的抗原呈递途径来说明基因疫苗的工作原理。,基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递,皮肤或者黏膜是具有高水平免疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的功能：参与粘膜局部免疫应答和产生分泌型IgA。而且在免疫动物时比较方便，尤其是大面积预防时，所以关于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活机体免疫反应机制的研究也比较活跃。 基因疫苗经过黏膜和皮肤组织免疫可以分为直接免疫机体和重组减毒胞内菌系统免疫两种形式。,（1）直接免疫 旅美中国科学家范泓然用皮肤涂抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成功，且检测其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细胞抗体型转化与Th0细胞向Th2细胞定向分化的微环境。基因疫苗经过黏膜免疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，同时启动Th2细胞功能，但其对细胞免疫（尤其是CTL细胞）活化不足，通过黏膜免疫获得的保护作用不如通过肌肉免疫获得的强烈。,（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特菌等重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感染途径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。因为它们可以将基因疫苗直接呈送给 APCs ，所以这种方法运送效率高、免疫方法简单、免疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。 减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs）如树突细胞（DCs）和巨噬细胞，在粘膜和全身淋巴组织诱发以 Th1 型应答为主的细胞免疫和体液免疫， APCs尤其是 DCs可能在其中起到了关键作用。,携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制,重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完全清楚。 可能途径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活，活化的 DCs 和巨噬细胞迁移到脾脏等淋巴组织（DCs 具有很强的迁移能力，而巨噬细胞尚有一些疑问），载体菌在此裂解，基因疫苗进入胞液，然后进入细胞核，最后表达目的抗原。接着激活特异的 CTL ，裂解表达抗原的 APCs ， APCs 内的抗原被释放激活辅助 T 细胞和诱导抗体反应，激活细胞免疫和体液免疫。 可能途径二：重组沙门氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡产物（含有目的抗原 / 基因疫苗）被邻近的 APCs 吞噬。,核酸疫苗的优缺点,优点：1 免疫保护力增强 2 制备简单，省时省力 3 同种异株交叉保护 4 应用较安全 5 产生持久免疫应答 6 贮存、运输方便 7 可用于防治肿瘤 缺点：1 质粒DNA可能诱导自身免疫反应 2 持续表达外源抗原可能产生一些不良后果 3 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取 4 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多 外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞,核酸疫苗的应用现状,有关质粒DNA疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们期望用核酸疫苗来征服诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并用于肿瘤、遗传病和其他多种疾病的基因水平治疗，所以作了多方面的尝试。 病毒感染性疾病的核酸疫苗 非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗 寄生虫核酸疫苗 肿瘤核酸疫苗,发展前景,核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童疫苗计划的长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。现在已获得了迅速的发展。它的研究具有深远意义，可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。,核酸疫苗研究 进展,一、概 述,核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒基因直接免疫机体 ，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。,（一）概 念,（二）DNA疫苗的构成： 1. 抗原表达基因 2. 真核细胞启动子（如CMV I.E启动子） 3. Poly A 终止序列（如来自SV40 或 BGH基因） 4. 原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因） 5. 增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷),二、DNA疫苗载体,1. 裸DNA疫苗：质粒、 MIDGE载体 2. 病毒载体： 天花病毒、腺病毒 3. 细菌载体：减毒活菌苗和繁殖缺陷细菌，如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶尔森氏菌苗 4. 微粒包裹载体：金颗粒(gold particle)、脂质体(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）、藻酸盐微粒(alginate)、和纳米微粒(nanoparticles),Various methods of gene delivery,三、DNA疫苗与常规疫苗的比较,DNA疫苗与常规疫苗比较,DNA疫苗与常规疫苗比较(续1）,DNA疫苗与常规疫苗比较(续2）,核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势：,(1)诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用； (2)无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性； (3)能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性； (4)与亚单位疫苗共有的高产性； (5)可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗； (6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用； (7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。,四、核酸疫苗诱导的免疫反应,核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应 关于核酸疫苗诱导全身免疫应答反应的机制目前了解的还不十分清楚，但其诱导过程可大致分为以下几个阶段： 疫苗的摄取、转运及表达； 抗原的加工和提呈； 淋巴细胞的活化； 免疫效应细胞和分子的作用。,Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA,Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific humoural and cellular responses.,五、核酸疫苗的构建,1、将亚单位疫苗的编码基因作为核酸疫苗的候选基因。 2、多肽合成疫苗的核酸推导序列作用核酸疫苗的候选基因 3、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因 31 免疫筛选法 32 化学分解法,候选基因的筛选原则,Ligate PCR product into pTARGETTM Vector,Transform TG1 cells,Selecte recombinant clones by ampicillin,pst酶切鉴定,挑取S基因正向插入的重组质粒pTARGET-hanS测序,重组质粒pTARGET-hanS的构建:,引物1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA 引物2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC,PCR,正向: 酶切成3674，1870，1470 反向: 可酶切成3674，2600,740,可酶切成5.6kb和1.3kb左右两个片段,EcoR酶切,琼脂糖凝胶电泳,回收5.6kb左右的大片段,对照空载体pTARGET的构建：,用连接酶连接,成为闭环pTARGET空载体,作为对照载体备用。,培养Vero-E6细胞,MEM培养基(10%FCS),37，5%CO2,细胞长至对数生长期,电穿孔转染重组质粒,转染后72h，收获细胞,检测核蛋白的瞬时表达,荧光显微镜下观察并拍照。,间接免疫荧光法,重组质粒pTARGET-hanS体外瞬间表达:,核蛋白的瞬时表达结果,作为DNA免疫的注射样品。,质粒的大量制备及纯化:,按分子克隆手册所述方法提纯质粒pcDNA3.1+和 pcDNA3.1+S,用灭菌的PBS溶解,调整浓度至1.0mg/ml,用分光光度计测定A260/A280比值以确定核酸样品的纯度，A260确定样品的浓度,实验动物的DNA免疫,68W 龄的BABC/c小鼠,空白质粒pcDNA3.1+,重组质粒pcDNA3.1+S,免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理,3天后,相同部位进行DNA接种,加强免疫一次，共免疫3次。,间隔2周,细胞因子的动态变化,常规方法分离脾细胞，浓度1107,24孔细胞培养板每孔加入脾细胞悬液0.5ml，NP10l(同时设空白对照孔， ConA刺激孔)均设3个复孔,37、5%CO2孵箱培养48小时后,收集脾细胞上清液，贮于-70，统一用ELISA kits 检测IL-4和IFN-,分别于免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d每组处死3只小鼠,淋巴细胞增殖反应:,脾细胞取自初次免疫后42d的免疫鼠,以重组的核蛋白刺激免疫小鼠的脾细胞,阴性对照孔和阳性对照孔(ConA),用MTT法检测脾细胞的增殖反应，计算刺激指数（SI）,常规方法分离脾细胞,浓度调整至2106,免疫鼠血清的抗NP抗体的测定:,免疫前和免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d经尾静脉采血,N=6/group,以被检标本复孔（3孔）OD值与免疫前血清（阴性对照）的比值2.1者为阳性。,重组的NP作为包被物，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗,ELISA法检测血清的抗NP抗体,血清抗NP抗体滴度的测定:,将初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血,N=6/group,留置血清，以10倍稀释为起点,再做系列稀释,ELISA法,检测血清抗体滴度,六、核酸疫苗的优化,1、免疫效果的优化,选择高效表达载体 添加DNA免疫激活序列,2、免疫途径的优化,肌肉注射（im）,基因枪导入,皮内(id)和皮下(sc)注射,黏膜表面接种,Effects of CpG motifs on various cells,Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs,2、免疫途径的优化,3、基因佐剂 的应用,细胞因子类 共刺激分子 分子佐剂联合,4、抗原蛋白的泛素化表达,IL-12、IL-15、IL-18及IFN-以增强Th1型细胞应答为主。 IL-4加强体液免疫,IL-2能同时加强体液免疫和细胞免疫 集落刺激因子,5、与基因重组疫苗联合应用,细胞因子产生的动态变化,细胞因子产生的动态变化,免疫鼠脾细胞的增殖反应,血清特异性抗体的检测结果,血清特异性抗体的检测结果,免疫鼠脾细胞的增殖反应,免疫鼠脾细胞的增殖反应,血清的抗NP抗体的测定结果,血清的抗NP抗体的测定结果,七、核酸疫苗的安全性问题,局部反应原性和全身毒性研究，即考虑DNA疫苗是否有免疫毒性作用，机体是否对疫苗编码的抗原产生耐受性，或是否导致自身免疫反应，还应对疫苗中污染的细菌蛋白是否诱发抗体产生进行评估； 遗传性作用，即质粒DNA是否与宿主基因组的整合问题； 生殖毒性研究，可采用PCR方法对经质粒DNA疫苗免疫的雄性或雌性动物的性腺DNA提取物进行检测 致肿瘤性研究，如果质粒DNA疫苗构建具有与人的基因组同源的DNA序列，或其载体含有已知的潜在致癌基因序列时，需展开这方面的研究。,1、有关基因整合的研究,一个最重要的理论危机是质粒DNA与宿主基因组整合的问题，因为当外源DNA与基因组整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，从而导致肿瘤细胞形成。,尚无证据证明以自身表达质粒的形式存在于染色体外的外源DNA能整合入宿主染色体中。 其整合发生率较自然整合发生率低3个数量级，另鲑鱼精DNA已经以一种非处方药形式经口服或注射等多种方式使用了数十年，却未见任何明显的副作用。,一些事实已清楚地证明脾内或口服裸DNA可能导致整合,2、关于免疫耐受的研究,外源性抗原的持续表达可能产生不良后果：耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等。 持续低表达-可被抗体中和清除， 无足够的免疫应答。 持续高表达-超免反应发生免疫抑制 其它病原感染。,免疫2天的小鼠产生耐受 免疫出生24小时内的小鼠，与在成年小鼠中观察到的没有区别。 HBsAg转基因小鼠进行DNA免疫，使已经建立的对HBsAg的特异性免疫耐受状态被打破，使小鼠产生抗HBsAg的特异性抗体。,实验结果：,结论：免疫耐受与抗原类型、浓度、给药方式及宿主种属、宿主年龄等因素有关。,3、关于自身免疫性疾病的研究,潜在性诱导抗质粒DNA的免疫反应是另一个必须关注的安全性问题。,研究表明： 用细菌DNA与mBAS及CFA形成的复合体免疫小鼠，能诱导小鼠产