培养基灭菌.ppt

1,2019/10/9,单元三 灭菌技术 教学目的与要求：了解灭菌的概念及必要性，掌握灭菌方法、湿热灭菌的原理、微生物的热死动力学、影响培养基灭菌的因素，以达到在工业生产上能进行简单的灭菌操作，并且能应用该理论解决简单的实际问题。,2,2019/10/9,教学重点：微生物的热死动力学、影响培养基灭菌的因素、分批灭菌设计、连续灭菌设计 教学难点：分批灭菌设计、连续灭菌设计,3,2019/10/9,绝大多数的发酵过程需要在无菌条件下进 行，因此培养基的灭菌必须合理的设计，使之既 能达到所需的无菌程度，又能保证培养基中有效 成分的破坏在允许的围之内,培养基的优劣直接关 系到实验和研究的成败与否及微生物发酵生产的 效率。,4,2019/10/9,主要内容,1. 灭菌的概念和必要性 2. 灭菌的方法 3. 湿热灭菌的原理 4. 培养基在工程上要解决的课题 5. 微生物的热死动力学 6. 影响培养基灭菌的因素 7. 分批灭菌设计 8. 连续灭菌设计,5,2019/10/9,一.灭菌的概念和必要性 灭菌：是指用物理或化学因子杀灭有生活 能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。 消毒：消除病原微生物的措施。 在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。,6,2019/10/9,灭菌的意义： 微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技术以来，许多发酵过程特别是氨基酸等新型发酵工业都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，不允许其他微生物存在（通常称之为杂菌）。,7,2019/10/9,如有杂菌，可引起以下的后果： 生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。 杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。 杂菌会污染最终产品。,8,2019/10/9,杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。 杂菌降解所需要的产物。 发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌 现象。,9,2019/10/9,工程上灭菌：是指使用物理或化学方法将培 养基中的杂菌的细胞和孢子杀灭至不影响发酵为限。 灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。,10,2019/10/9,11,2019/10/9,12,2019/10/9,二. 灭菌的方法(所有的灭菌，不全针对培养基） 微生物细胞是由蛋白质组成，加热可导致蛋白质变性，从而达到消灭微生物的目的。微生物对高温的敏感性大于对低温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。细胞内蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内的含水量越大，蛋白质凝固越快。,13,2019/10/9,1、湿热灭菌 根据被灭菌物品的不同，选择各种不同温度的蒸汽进行灭菌，是工业上常用的灭菌方法。湿热灭菌简便、有效、经济。,14,2019/10/9,（1）煮沸法：煮沸100，5分钟，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮沸56小时才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点105，既可促进芽胞的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。,15,2019/10/9,（2）流通蒸汽灭菌法：利用100左右的水蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15-39min，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧以利于蒸汽穿透。,16,2019/10/9,（3）间歇灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽，以达到灭菌的目的。一般用流通蒸汽灭菌器，100加热1530min，可杀死其中的繁殖体；但芽胞尚有残存。取出后放37孵箱过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再蒸一次，如此连续三次以上。本法适用于不耐高温的营养物（如血清培养基）的灭菌。,17,2019/10/9,（4）巴氏消毒法（Pasteurization）：利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌，同时不致严重损害其质量的消耗方法。由巴斯德创用以消毒酒精类，故名。加温61.162.8 30min，或71.7 1530s。常用于消毒牛奶和酒类等。,18,2019/10/9,（5）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。 目前使用的压力灭菌器可分为两类：下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器，适用于耐高温、耐水物品的灭菌。,19,2019/10/9,2、干热灭菌 干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。 （1）干烤：利用干烤箱，加热1601802小时，可杀死一切微生物，包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。,20,2019/10/9,（2）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。,21,2019/10/9,(3) 红外线：红外线辐射是一种0.771000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以110微米波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产,22,2019/10/9,生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似，利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的灭菌。 人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；长期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜。,23,2019/10/9,（4）微波：微波是一种波长为1mm到1m左右的电磁波，频率较高，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。,24,2019/10/9,一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。,25,2019/10/9,微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后才开始操作。,26,2019/10/9,（5）紫外线 紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对其抵抗力大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。一般无菌室、超净工作台和摇瓶间等可采用30w紫外灯泡照射20-30min，以波长2600A左右灭菌效果最好。,27,2019/10/9,在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有： 蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较大同一温度的干热空气中易于凝固。,28,2019/10/9,温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。 湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。,29,2019/10/9,3. 化学药剂灭菌 （1）0.1%0.25%KMnO4溶液：用于皮肤、水果及饮具的消毒； （2）0.5%1%漂白粉溶液：用于环境消毒； （3）75%酒精：用于皮肤及玻璃器皿表面消毒； （4）0.25%新洁尔灭：用于皮肤和小器皿表面消毒及环境消毒；,30,2019/10/9,（5）10%甲醛溶液：用于无菌室、摇瓶间及车间的熏蒸消毒； （6）苯酚溶液：2-5%的苯酚溶液用于器械及车间环境的喷雾消毒； （7）来苏尔，非典时期大量用的84消毒液：消毒皮肤桌面及用具等。,31,2019/10/9,三. 湿热灭菌的原理 湿热灭菌：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出 大量潜能，并且蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障而死亡。 湿热灭菌的效果，取决与致死温度和致死时间。 致死温度：是杀灭微生物的极限温度。 致死时间：是在致死温度下杀灭全部微生物所需时间。,32,2019/10/9,热阻（对热抵抗力）：微生物在某一特定条件（一定 的温度、加热方式）的死亡时间。 相对热阻：指在相同条件下两种微生物热阻的比值。 芽孢的热阻特别高的原因：芽孢具有吡啶二羧酸，能增强对热抵抗力芽孢厚而且结构致密，热不易透过芽孢的游离水分少，蛋白质含水量较营养细胞蛋白质含水量低。 在实际生产中，由于不能完全了解杂菌的数量和类型，因此要以相对热阻大的芽孢作为灭菌的依据。,33,2019/10/9,工业上湿热灭菌分为分批灭菌和连续灭菌 分批灭菌（实消）：将培养基置于反应器中用 蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一定时间， 再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫分批 灭菌。 连续灭菌（连消）：将培养基在罐外连续进行 加热、维持和冷却然后进入到反应器的杀菌方 法就是连续灭菌。,34,2019/10/9,35,2019/10/9,36,2019/10/9,37,2019/10/9,四.培养基在工程上要解决的课题 将培养基中的杂菌总数杀灭到可以接受的总数需要多高的温度、多长的时间。选择最佳灭菌条件，达到既杀灭杂菌又尽量减少营养成分的破坏。,38,2019/10/9,五. 微生物的热死动力学 1、微生物的热阻 每一种微生物都有一定的生长温度范围，当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停滞且处于休眠状态。相反温度超过最高限度时，细胞中的原生质胶体和酶蛋白就几乎发生不可逆的凝固变性，使微生物在很短的时间内死亡。,39,2019/10/9,致死温度：是杀灭微生物的极限温度。 致死时间：是在致死温度下杀灭全部微生物所需时间。 热阻（对热抵抗力）：微生物在某一特定条件（一定的温度、加热方式）的死亡时间。,40,2019/10/9,2、对数残留定律：在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学即微生物的热死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。 热死灭动力学方程 dN/dt =-KN 式中： N- 残存的活菌数（个） t- 灭菌时间（min） K- 杀菌速率常数（min-1）或叫死亡速率常数。 K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，其大小与微生物的种类和加热温度有关。 dN/dt- 菌的瞬时变化率，即死亡速率。,41,2019/10/9,将方程积分后得： N0：开始灭菌(t=0) 时原有活菌数 Ns：经时间t后残存活菌数 D值：活的微生物在受热过程中减少到原来数目的1/10（ Ns/N0= 1/10）,42,2019/10/9,3. 温度对杀菌速率常数K的影响 微生物受热蛋白质变性而死亡，温度对杀菌速率常数的影响可以用阿累尼乌斯（Arrhenins)方程表示：K=Ae-E/RT K- 杀菌速率常数（死亡速率常数）（min-1） A- 频率因子（阿累尼乌斯常数），因菌种的不同而异。 E-活化能（J/mol） T-绝对温度（K）T= t +273.15 R-气体常数 8.36J/mol.K(或1.98cal/mol.K),43,2019/10/9,活化能: 在反应动力学中指出，分子的碰撞只有某些分子的碰撞才是有效的碰撞。这些分子在碰撞时，所具有的内能比在该温度下其它分子所具有的平均内能要大，正是这种过剩的能量才是分子在所指的条件下进行反应所必需具备的能量，这个能量就是活化能。,44,2019/10/9,从阿累尼乌斯方程可以得出以下结论： 1）活化能E的大小对K值有重大影响，其他条件 相同时E愈高，K值愈低，热死速率愈慢。 2）不同菌的孢子热死反应的E可能各不相同，在 相同T灭菌，尚不能肯定E低的孢子的死亡速度一 定比E高的快，因为K并不是唯一决定于E。 3）对方程两边取对数得： lnK= - E/RT + lnA,45,2019/10/9,在不同的温度T下做灭菌实验，求得相应的K值，按lnK-1/T作图，从直线的斜率可以求出E。 4）K是E和T的函数，K对T的变化率与E有关。 反应的活化能E愈高，温度T的变化对K的影响愈大。 对上式两边求导数得：dlnK/dT=E/(RT2),46,2019/10/9,六. 影响培养基灭菌的因素 1. 营养成分的保持 湿热灭菌时，微生物被热死的同时，培养基的 营养成分也遭到了一定的破坏。特别是氨基酸和维 生素。在热的作用下某些营养成分还可能因受热而 相互之间发生反应，造成培养基中原有营养成分的 数量变化，因而影响培养基质量。,47,2019/10/9,例如：还原糖与氨基酸、肽、蛋白质等发生化学反 应，形成5-羟甲基糠醛和类黑精。 培养基成分受热分解的反应也是属于一级反应，符合对数残留定律和阿累尼乌斯方程： - dc/dt=KC K = Ae-E/RT K-培养基成分的破坏速度常数 E-培养基营养成分破坏的活化能,48,2019/10/9,养分虽因温度增高破坏增加，但灭菌时间虽短，破坏量减少。,49,2019/10/9,50,2019/10/9,实验表明细菌孢子热死反应的活化能E很高，营养成分破坏的活化能较低。随着温度上升，菌体孢子死亡速度常数增加倍数大于培养基成分破坏速度常数增加倍数。所以当温度升高时，杂菌死亡速度要比营养成分破坏速度快得多。根据这一原理，培养基灭菌采用高温短时的方法能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。,为什么要采用高温短时灭菌,51,2019/10/9,2. 微生物的耐热性 细菌芽孢的热阻较大，灭菌所需要的时间取决于把细菌芽孢减少到所规定数目的时间。同时一个细菌只能形成一个芽孢，故把培养基中细菌和芽孢数之和作为计算依据比较合理。,52,2019/10/9,3. pH值 对微生物的耐热性影响很大 pH值=6.08.0时，微生物最不易死亡 pH6.0时，微生物比较容易死亡，此时H+很容易渗入微生物的细胞，从而改变细胞的生理反应，促使其死亡。所以培养基的pH越低，所需的时间也越短。,53,2019/10/9,54,2019/10/9,4. 培养基成分 高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜，影响热的传入。而高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，灭菌较易。 例如：大肠杆菌在水中加热至60-65便死亡，在10%糖液中需70加热4-6分钟才死亡，在30%糖液中需30分钟才死亡。,55,2019/10/9,5. 泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中的杂菌。因此灭菌时需要加入适量的消泡剂。,56,2019/10/9,6. 颗粒 颗粒小，容易灭菌，颗粒大，则难灭菌。 对于含有少量较大颗粒及粗纤维的培养基，可用粗滤的方法（不应影响培养基质量）予以除去，培养基结块会造成培养基灭菌的不彻底，必须注意。,57,2019/10/9,七. 分批灭菌设计 分批灭菌不需其它设备，操作简单易行。省去了连消设备和操作，节省了动力。缺点是升温慢、降温也慢，增加了发酵前的准备时间，延长了发酵周期，设备利用低，而且无法采用高温短时灭菌，因而不可避免的使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏，但是国外通过采取增大搅拌功率，增大冷却面积等措施，充分利用其优点而避免其缺点，即使大罐也采用实消。,1.基础条件的确定 污染度N0 灭菌开始时，培养基中的杂菌的个数（个）N0应取芽孢细菌数和细菌芽孢数之和。,59,2019/10/9,灭菌度Ns 经过灭菌时间t后，培养基中残存的活菌个（个) 也称为杀菌程度。如要求灭菌绝对无菌则Ns=0， 则t=。这是无法做到的。工程上通常上取 Ns=10-3个/罐，即灭菌1000只罐，只残留1个杂 菌或灭菌1000次，只残留一个杂菌,是个概率 指数。,60,2019/10/9,杂菌的热死特性的选择 由于最耐热的芽孢一般很少发现，所以在灭菌计算时不是把所有的细菌当作最耐热的芽孢，而是通常用一般耐热的细菌芽孢的K值。 K=Ae-E/RT=7.941038e-68700/1.98T,61,2019/10/9,灭菌程度的指标 N0/Ns:在分批灭菌设计中，为了计算的方便取V=ln N0/Ns（灭菌准数，Del值），作为设计的依据，也是设计成功与否的判据。,62,2019/10/9,例：培养基100m3，含菌105个/ml，要求灭菌后杂菌数Ns=10-3 则：N0/Ns=(100106 105)/10-3=1016 ln N0/Ns=36.8,63,2019/10/9,2.灭菌曲线,64,2019/10/9,lnN0/Ns=Kt 因为：lnN0/Ns= ln(N0/N1 N1/N2 N2/Ns) lnN0/Ns= lnN0/N1+ lnN1/N2+ lnN2/Ns lnN0/Ns是由三块积分面积升温阶段lnN0/N1、 保温阶段lnN1/N2、降温阶段lnN2/Ns合成的。 可以合理设计这三块面积的大小，使其和等 于灭菌准数lnN0/Ns。,66,2019/10/9,然而分批灭菌的T-t过程曲线不是任意给定的。它决定于加热方式、换热面积的大小、传热系数的高低、换热介质的温度及培养基的质量等多种因素。,67,2019/10/9,68,2019/10/9,69,2019/10/9,3.分批灭菌讨论 对于工业规模的灭菌操作，完成整个灭菌 周期一般约需35h，其各阶段对灭菌效果 贡献大致如下： V加/V总=0.2 V保/V总=0.75 V冷/V总=0.05,70,2019/10/9,八. 连续灭菌设计 连续灭菌可以采用高温短时,使培养基养分破坏减少到最低限度，从而增加生产率,并且缩短了发酵周期。 对于黏度过大或固体成分较多的培养基，要实 现连续灭菌困难较大，设备较复杂，投资大，且在发酵罐外附加的设备可能造成二次污染的机会。,71,2019/10/9,定义流体在反应器中的平均停留时间为 则： = V/Q V-反应器中液体所占的体积(L , m3) Q-通过反应器的液体流率(L/min, m3/h) 假如任一物料微团在反应器内所经历的时 间等于平均停留时间，则可以实现升温、 保温、降温过程接近以下的T-t图,72,2019/10/9,73,2019/10/9,然而上述假设实际难以成立。在实际的反 应器中，与流动方向相垂直的截面上存在 着不同的流速分布，这必然存在物料微团 间的轴向混合。这种是经历了不同反应时 间的物料的混合，称为反混。,74,2019/10/9,75,2019/10/9,（一）连续灭菌器的流体流动模型 1、活塞流模型（PF） 在反应器内与流体流向相垂直的横截面上 的径向流速分布是均一的，即完全不存在 返混。实际上，长径比很大的管式反应器 接近与这种理想的流型。,76,2019/10/9,2、连续式全混流模型（CFSTR) 这是另一种理想化的流型。设定反应器内 的混合足够强烈，因而反应器内物料的浓 度处处相等，反应速度也处处相等，不随 时间而变。搅拌强烈的反应器，可以接近 于CFSTR特性。要在同一温度下灭菌，达 到同样的灭菌效果，CFSTR的灭菌时间比 PF长的多。,77,2019/10/9,3、扩散模型 高径比不大的反应器如短管式或塔式反应 器内的流体流动，具有不大的返混。可以 把这种流动简化为活塞流和轴向扩散的叠 加。,78,2019/10/9,（二）连续灭菌流程 连续灭菌因加热和冷却设备的不同，可有各种流程形式。一般在连续灭菌时，应采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的冷却时间。 1、连消塔喷淋冷却流程 图8-8 2、喷射加热真空冷却流程 图8-9 3、薄板热交换器连续灭菌流程 图8-10,79,2019/10/9,80,2019/10/9,这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸汽直接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。该流程是比较陈旧的设计，设备较庞大；维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。,81,2019/10/9,为了提高热量利用和节约冷却水，可采用一台套管式换热器或板式换热器置于维持罐及冷却器中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。,82,2019/10/9,83,2019/10/9,图8-9所示，是一种喷射加热、管道维持、真空冷却的连续灭菌流程。生培养液先用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷咀喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进入管道维持器，经一定时间后通过一膨胀阀进入真空闪急蒸发器而冷却至70-80，在进入发酵罐冷却到接种温度。,84,2019/10/9,此流程的优点是：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏少，可以采用高温灭菌，把温度升高到140而不至于引起培养基营养成分的严重破坏。设计合适的管道维持器能保证物料先进先出，避免过热。但如果维持时间较长时维持管长度就很大，给安装和使用带来不便，所以象酒精厂的醪液蒸煮等大多仍采用维持罐。,85,2019/10/9,灭菌温度取决于喷射加热器中加入蒸汽的压力和流量。要保持灭菌温度很定就要使蒸汽压力及培养基流量稳定，故易设置自控装置，如自控的滞后较大，也会引起操作不稳定而产生灭菌不透或过热现象。,86,2019/10/9,此外，由于真空的影响，需要在蒸发室下面装一台出料泵，或将蒸发室置于离发酵罐液面10米以上的高处，否则物料就不能流进发酵罐而进入真空系统，这就给生产带来不便，尤其对于已经灭菌好的培养基来说，出料泵的密封程度要求很高才能避免重新污染，这个问题也是目前许多工厂不采用真空冷却的原因之一 。,87,2019/10/9,88,2019/10/9,薄板换热器由于具有设备紧凑、占地面少、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏物料产生局部过热现象等优点，被广泛用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、冷却或灭菌之用。,89,2019/10/9,图8-10所示是采用板式换热器的连续灭菌流程，生培养液进入板式换热器的热回收与熟培养液先进行一次热交换达到预热，以便提高热量的利用率，然后进入加热阶段到灭菌温度后引入维持器进行保温，灭菌好的熟培养液再进入热回收段作为生培养液的加热介质，同时本身也得到一定程度的冷却，最后进入冷却阶段用冷却水冷却到所需培养温度。,90,2019/10/9,板式换热器的特点是：培养基在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。虽然加热和冷却生培养液所需时间比使用喷射式连续灭菌较长，但灭菌周期比分批灭菌小得多。由于生培养基的预热过程即灭菌培养基的冷却过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量，板式换热器的缺点是制造加工复杂，必须有专业厂成批生产，密封要求高，密封填圈易损坏，需经常调换。,91,2019/10/9,（三）连续灭菌计算 连续灭菌过程中，加热和冷却所需时间极 短，为简化计算，可以把加热和冷却阶段 效果略去。因而，只有维持器的计算与灭 菌程度相关。, 维持罐 由式：t2=2.303/Klg(N0/Ns)可以求出连