质粒载体的构建.doc

质粒载体的构建摘 要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5感受态细胞中复制表达。关键词： 质粒 DNA PCR 电泳 感受态 转化 1. 引言质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，15kb的小质粒比较容易分离纯化，15kb的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的获得 2.1.1 引物设计第一次引物设计： 正向引物： sinn3F 冰盒标注：P2a 引物序列：5 AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b 引物序列：5 GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA3 引物长度：22bp第二次引物设计（带酶切位点）： 正向引物： sinn3FE 冰盒标注：P2c 引物序列：5 ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物长度：34bp 反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P2d 引物序列：5 TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT3 引物长度：34bp2.1.2 PCR扩增 2.1.2.1 PCR技术的基本原理PCR即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程.是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面. PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2PCR反应的基本步骤: 1.变性: 高温使双链DNA解离成单链.（94 30s） 2.退火:低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子.（55 30s） 3.延伸:中温延伸. 在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下, DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5向3方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链. （70-72 30-60s） 以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n形式增加.2.1.2.2 PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法 2.1.2.3 PCR反应体系第一次PCR扩增:调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb）: PCR反应体系2*100ul（每管25ul,共8管） Pyrobest 2ul buffer（10x） 10ul WT4（模板） 2ul P2a（10uM） 4ul P2b（10uM） 4ul dNTP（2.5x） 2ul ddH2O 76ulPCR反应条件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 53 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见2.1.3电泳）,切胶回收目的DNA条带,共切3管,分别标注A、B、C.首先用25ul约60的无菌蒸馏水洗脱A管一次,洗脱液标注1,分别用15ul的无菌蒸馏水洗脱B管和C管,得到的DNA洗脱液标注2,最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管,得到的DNA洗脱液分别标注a、b、c.第二次PCR扩增（带酶切位点）: 分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板,进行第二次PCR扩增,设计反应体系（各25ul）如下: 模板2 模板a 模板b 模板c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul buffer（10x） 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 模板 0.5ul 2ul 4ul 6ul P2a（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul P2b（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul dNTP（2.5x） 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul ddH2O 19ul 17.5ul 15.5ul 13.5ulPCR反应条件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 54 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever电泳结果表明:以2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带,依据此次电泳结果,可先后再利用PCR扩增（各100ul,每管25ul,共8管） PCR反应体系2*100ul（每管25ul,共8管） 模板2 模板c Pyrobest 2ul 2ul buffer（10x） 10ul 10ul 模板 4ul 40ul P2a（10uM） 4ul 4ul P2b（10uM） 4ul 4ul dNTP（2.5x） 2ul 2ul ddH2O 74ul 38ulPCR反应条件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 54 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever电泳条带明显而且明亮,切胶回收保存待用.。2.1.3 电泳 2.1.3.1 配胶 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（1X TAE Buffer） 根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉（1g）,加入适当的锥形瓶中。 加入一定量的电泳缓冲液（1X TAE Buffer 100ml）。 熔化完全，冷却至600C左右，加入EB5-7ul，充分混匀。 将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。 室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放40C 保存，一般可保存2-5天。2.1.3.2 电泳 取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的DNA Maker 加入右边槽中，开始电泳。2.1.3.3 紫外观察电泳条带 当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带（1kb处） 2.1.4 切胶回收目的DNA切胶回收目的DNA的方法步骤： 操作流程见右图，全套操作约需30分钟，详细说明如下。1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。凝胶浓度 DR-I Buffer使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%1.5%4个凝胶体积量1.5%2.0%5个凝胶体积量3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 l进行计算。5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表： 6. 均匀混合后75加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约610分钟）。注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，3,600 rpm离心1分钟（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1分钟），弃滤液。注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。10. 将500 l的Rinse A加入Spin Column中，3,600 rpm离心30秒，弃滤液。11. 将700 l的Rinse B加入Spin Column中，3,600 rpm离心30秒，弃滤液。12. 重复操作步骤11，然后12,000 rpm再离心1分钟。13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 l的60水或洗脱液，室温静置1分钟。14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 2.1.5 目的DNA加尾 用25ul的无菌蒸馏水洗脱DNA，再用20ul的无菌蒸馏水洗脱，共得约40ul的洗脱液，然后抽真空使其浓缩至约8ul。加尾10ul体系： 8ul DNA 1ul Buffer（10x） 0.5ul dATP 0.5ul Taq酶PCR条件：72 30-40min 降至4即可 2.1.6 连接T-DNA 连接10ul体系： 1 ul T4 ligase 1 ul Buffer（10x） 1 ul T-DNA 7 ul DNA-PolyA 连接条件： 4000rpm甩30sec 4过夜2.2 感受态DH5的制备2.2.1 基本原理 转化是将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状. 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,可以容忍外源的DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代,受体细胞经过一些特殊的方法,如电击、CaCl2等化学试剂处理后,细胞膜的通透性增加,成为感受态细胞,使外源的DNA分子可以进入. 2.2.2 方法步骤目前常用的感受态细胞制备方法有电击法和CaCl2法, 电击法制备效率较高,但CaCl2法简单易行,且其转化效率可以满足一般的实验要求,因此CaCl2法使用更为广泛. CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤: 准备: （1） 配制0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,高温高压灭菌. 注: CaCl2必须为分析纯以上,（2） 实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌. 注:最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材.（3）受体菌的培养:从非选择性LB培养基上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中, 37振荡培养过夜至对数生长期中后期.将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100ml LB培养基中, 37振荡培养2.5小时至OD600=0.5. 注:培养时间不宜超过2.5小时,否则不能达到最高转化效率.实验步骤:（1）细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,45000rpm离心5分钟.（2）用欲冷的去离子水洗涤沉淀, 45000rpm离心5分钟.（3）沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟, 0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液（4）沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液.分装成50-100ul的小份,置于-70可保存半年.注:最好在两个月内用完,然后重新制备.若要进一步提高转化效率,可将加入的溶液体积减少到1ml或分装成200ul/管. 电转化法制备感受态大肠杆菌的方法步骤:（1）前夜接种受体菌（DH5）,挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜.（2）取2ml过夜培养物接种于200ml LB培养基中, 37摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.5（约2.5-3小时）.（3）将菌液迅速置于冰上,以下步骤务必在超净工作台和冰上操作.（4）吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟.（5）43000rpm冷冻离心5分钟（6）弃去上清,加入1500ul冰冷的10甘油,用移液枪上下吸动打匀,使细胞重新悬浮.（7）43000rpm冷冻离心5分钟（8）弃去上清,加入750ul冰冷的10甘油,用移液枪上下吸动打匀,使细胞重新悬浮.（9）43000rpm冷冻离心5分钟（10）加入20u