生物制药工艺学第12章制备型HPLC.ppt

第十二章 制备型高效液相色谱,制备型高效液相色谱的用途：,1重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规模生产的必备手段。,2天然产物中活性物质发现的重要手段: 蛋白质,多肽,多糖。抗菌肽 3从天然产物来源药品生产的重要手段：胰岛素，蕲蛇酶。 4实验室制备样品用于临床试验和报批。 5 在 2-D 电泳, blotting, ELISA 等之前的样品制备。,第一节 高效液相色谱法简介,1.1 液相色谱的发展史 1903年，色谱法问世。 俄国植物学家茨维特 1903年3月21日， 大会报告 “一种新型 吸附现象及其在生化 分析上的应用” 1906年 在德国植物学杂志发表 文章，首次命名上述分 离后色带为色谱图，称此方法为色谱法,1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。,60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制 高效填料，高压泵，仪器检测,1.2 基本仪器装置,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 收集系统 数据处理系统,2 1 高效液相色谱仪组成,1 输液系统,(1) 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。,(2)在线脱气装置 作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气 装置再输送到色谱柱。 超声脱气、真空脱气等,脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。,Pressure Dampers,O2, N2, CO2,（3）梯度洗脱装置,Isocratic elution,恒定组成的单一溶剂体系,Gradient elution,以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗， 目的是分离多组容量因子相差较大的组分,High-Pressure Mixing,2 进样系统,六通阀,3 分离系统,3.1色谱柱,3.2色谱柱填料,spherical and irregular silica particles,Macroporous spherical silica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979,基质：载体或担体。数m数十m，球形。 硅胶或有机高分子聚合物,Pellicular particle,Porous particle,30-50m,1-2m,3-10m,3.3色谱柱填料,功能层：物理吸附或化学键合,检测系统：,收集系统：,数据处理系统：,三、高效液相色谱法的特点,采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。 和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高 等。,四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别,输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能,检测器中的检测池不同 ： 体积不同 色谱柱不同： 规格主要是直径，粒径的大小,制备色谱一般配有电导检测器和pH值检测器分析型色谱没有： 制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有,五、色谱的基本理论及有关参数,两大理论： 塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2,速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu,有关参数,容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。容量因子k与柱效参数及定性参数密切相关，而且比分配系数易于测定，在色谱分析法中一般都是用容量因子代替分配系数。,选择因子（selectivity factor,）： 相邻两组份的分配系数或容量因子之比。设k2k1，则k2/k1，所以又称为相对保留时间（美国药典）。要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。,分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全. 只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。 在色谱分析中要求： 两组分的保留值差别要足够大。 两色谱峰要足够窄。 待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.,六、制备型高效液相色谱的重要参数：,Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。 Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。 Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。,七、分离机理和色谱类型,分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性,色谱介质按分离机理分为,正相色谱： 反相色谱：常加入TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基S磺酸基） 凝胶过滤色谱： 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱 :,第二节 分离方案的设计,What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be removed? What must be removed completely? What will be the final scale of purification? What are the economical constraints and what resources and equipment are available?,一、分离方法之间的组合 四步纯化法： Preparation: Capture:(Isolate,concentrate and stabilize) Intermediate purification:(Remove bulk impurities) Polishing:(Achieve final high level purity）,色谱之间的组合方案 AC、GF、IEX、HIC,二、分离条件的优化 合适的溶剂强度:容量因子k 足够的柱效N: 良好的分离选择性:,当柱过载时： 1 N和k都随样品负荷的增加而迅速地减小 2 流速对于塔板数N的影响大大地降低 3 通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过降低柱压（或流速）来达此目的,制备分离的两种途径： 第一种，基本上同于分析型，进样量不过载，利用大内径的柱，通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料（约10m）来制取少量价值高而难分离的物质。 第二种，使用大粒度填料（50m）的大内径柱，在过载情况下制备相对大量的纯物质。当值相当大时（例如1.2），提高洗脱液的流速并不至于严重降低分离度，从而大大缩短分离时间。,三、制备型高效液相色谱常见问题及解决办法,待分离成分呈单一主峰 不易分开的两组分 目的组分含量少,待分离成分呈单一主峰,不易分开的两组分,目的组分含量少,第三节 实验条件的选择,色谱柱的选择与填装 柱填料 流动相选择 检测器的选择 仪器设备,一、柱的选择和装填 柱： 不锈钢柱： 200kg ，生物适应性差 玻璃柱：1015kg 聚合物柱： 装填： 当粒度小于20m，用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于30m时；利用轻敲柱外壁的干填法,二、柱填料,硅胶： 葡聚糖和琼脂糖： 高分子聚合物：,颗粒大小,在很小的分离制备中，要求较高的N值，宜用小粒度的填装柱。 当很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处。,三、洗脱剂,可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比，离子强度，pH等），将其直接或略加修改后用于制备分离 一般不采用梯度洗脱 选择合适的溶剂溶解样品 采用色谱纯的试剂,四、仪器设备,对泵的精密度和准确度要求不高（ 0.01100mL/min ） 对检测器的高灵敏要求不高 流路系统尽可能用惰性聚合材料 柱外效应试验结果影响较小,第四节 操作变量的确定,一、样品的进样量 宜注射低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度小体积的样品。 样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。,二、制备产率,产率随分离度的提高而增加。 不过载的柱子，k值较小时，产率较高。 用全孔填料时产率高于用薄壳型的。 对于值小的分离，宜利用小粒度（510m）填料的柱子；在较大时，使用较大颗粒、大内径的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。 柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。 产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。,三、回收率计算和纯度鉴定,除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，冷冻干燥。 纯度：HPLC，TCL。 回收率：重量，活性。,第五节 应用实例-蛇毒中溶栓组分的分离,制备型高效液相色谱的应用,肽的分离 蛋白质的分离 多糖的分离 核酸的分离,肽的分离： 常用方法为反相色谱和离子交换色谱 肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。 反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。 肽的检测：UV200230nm，荧光检测。,蛋白质的分离,1填料：孔径300500 2流动相 （1）pH 低pH使蛋白质羧基解离受到抑制，极性降低，与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言，使用pH2.53.5的流动相可以得到最好的分离。,（2）离子强度和离子对试剂 增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用，较高的离子强度（0.2）可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。 缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则复合离子对保留时间减少。,（3）有机溶剂 有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。 使用复合溶剂（如异丙醇-乙醇、乙腈-异丙醇等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。,（4）表面活性剂 两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，使分离得以改善。 （5）温度 为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，分离一般在室温或低温下进行。,三、多糖的分离 分离：高效体