细菌毒素

第五章 细菌毒素,细菌毒素：是一类特殊的细菌代谢产物，在宿主体内能选择性与靶细胞膜上相应受体结合，然后作用于特定靶点，直接或间接导致靶细胞功能异常或损伤，甚至死亡，引起宿主出现相应病理反应。,G+/G- cell wall,根据细菌细胞壁的构造和化学组成不同，可将其分为G+/G- G+：细菌的细胞壁较厚（20-80nm),但化学组成比较单一，只有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸； G-细菌的细胞壁较薄（10-15nm),却又多层构造（肽聚糖脂多糖层等），其化学成分中除含有肽聚糖以外，还含有一定量的类脂质和蛋白质等成分。,一 根据毒素分子性质与结构分类 多糖毒素 细菌的非蛋白产物有核酸、脂类和多糖等，但只有脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）被一致公认为细菌毒素，即内毒素。LPS是G-细胞壁的主要成分之一。在细菌存活时，LPS只是细胞壁的结构成分和菌体抗原，只有当细菌死亡裂解，LPS游离后才作为毒素起作用。 蛋白毒素 又称外毒素，依据肽链结构可分： 1 A-B型毒素 2 单肽链毒素 3 小分子多肽毒素,二 外毒素（exotoxin) 1 概念 细菌生长过程中产生和分泌到细菌细胞外的毒性蛋白质。 2 特点 1)由细菌产生的非结构蛋白质成分 2)高毒性 3)良好的抗原性 4)特异性 5)不稳定,1)本质为蛋白质(一般是可溶的蛋白质），典型的外毒素A-B模式 A 亚单位-决定毒性 B亚单位结合活性部分，与靶细胞上受体结合（无毒性）,2）高毒性 通常只有毒性菌株才能产生毒素，而非毒性菌株不能产生毒素 外毒素是毒力因子的主要决定因素 外毒素的毒性通常非常强 3）良好的抗原性 类毒素（Toxoids）:由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素，但仍保留其抗原性。 抗毒素是一种含有抗体的血清制品。它是把类毒素给马注射，使其产生大量抗体，然后采取马血清，将其精制浓缩而成（治疗作用）,4）特异性：选择性强 高度生物活性，类似酶催化的作用方式 对底物具有高度选择性 作用模式高度专一 只攻击特定的细胞 损伤位点显示毒素作用位点 5）不稳定： 对热、酸和蛋白酶敏感,3 来源： 产生外毒素的细菌主要为G+菌，但越来越多的G-菌也发现能产生外毒素。 大多数外毒素为分泌型，少数则存在于细菌细胞内，当细菌裂解后才释放到细胞外。有的为无毒的毒素前体通过肠道内的蛋白酶或细菌产生的酶激活后才具有毒性。 4 理化及生化特性 具有蛋白质的基本特性：温度、化学药品敏感 类似于酶的特性：蛋白质、高生物学活性、作用的专一性,5 分 类,根据毒素作用的器官不同，可分为细胞毒素、肠毒素、神经毒素等 细胞毒素:白喉毒素、葡萄球菌表皮剥脱毒素、葡萄球菌毒性休克综合征毒素、A群链球菌致热外毒素 肠毒素 霍乱肠毒素、ETEC肠毒素、产气荚膜梭菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素 神经毒素；破伤风痉挛毒素、肉毒毒素,5 分类,根据毒素的作用机制，可分为膜损伤、抑制蛋白质合成、激活刺激信使通路、激活免疫应答和蛋白酶等。,7 外毒素的作用方式（MODE of action） 1） 作用细胞膜 Damages membranes-forms pores 2）作用于酶 Inhibit protein synthesis- N-glycosidase 糖苷酶 Activate 2nd messenger pathways-ADP-ribosyltransferase 核糖基转移酶 Protease-Zinc-metalloprotease 金属蛋白酶 3）激发免疫反应-superantigen,二 内毒素(endotoxin) 概念：G-菌细胞壁脂多糖，菌体崩解时释放，性质稳定。 细菌的非蛋白产物有核酸、脂类和多糖等，但只有脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）被一致公认为细菌毒素，即内毒素。LPS是G-细胞壁的主要成分之一。在细菌存活时，LPS只是细胞壁的结构成分和菌体抗原，只有当细菌死亡裂解，LPS游离后才作为毒素起作用,1 来源： G- 2 化学成分、结构 脂多糖，包括： 类脂A， 核心多糖， 特异多糖,3 特点： 1）低毒性： Cause a wide variety of serious reactions such as fever,shock,changes in blood pressure, and in other circulatory functions. 2）弱抗原性， 不能产生类毒素,3）特异性不高： Endoxins are toxic to most mammals Regardless of the bacterial source, all endotoxins produce the same range of biological effects in the animal host 发热反应，白细胞反应，内毒素血症与内毒素休克 4）相对稳定，耐热 Boiling for 30 min does not destabilize endotoxin Certain powerful oxidizing agents such as superoxide, peroxide and hypochlorite, have been reported to neutralize them,4 结构,LPS包括： Lipid A特殊的糖磷脂，由焦磷酸键联接的氨基葡萄糖聚二糖链，并结合有多种长链脂肪酸，是内毒素的毒性成分。 各种G-的Lipid A的化学成分和结构虽有差异，但极为相似，无种属特异性，所有G-菌内毒素引起的毒性作用大致相似。 非特异性核心多糖 外与O抗原相连，内与Lipid A相连。 O 特异性多糖 又称O侧链或O抗原多糖 低聚糖（3-5个）组成的重复单位（10-40个），重复单位的数量、单糖种类、位置及排列顺序因菌种而异。,6 内毒素的检测 1）制药业 静脉注射和皮下注射的药物，医疗器材 2）环境监测 室内和室外空气质量，水污染 3）医学 G-细菌的感染 败血症等诊断：是指细菌进入血液循环，并在其中生长繁殖、产生毒素而引起的全身性严重感染。,7 细菌内毒素的检测方法 1）生物学检测方法 Rabbit Pyrogen test 热原检查 Limulus Amebocyte Lysate test 鲎变形细胞溶解物 Neutrophil Chemiluminescence test 化学荧光法 2）非生物学检测方法 化学标记物（脂多糖中的脂类） 检测能特异性识别脂多糖的分子。,热原检查 20世纪最经典的方法 4小时-从兔子耳朵注射药物，测定兔子体温 This test, which took app. 4 hrs, is accomplished by injecting the substance being analysd into a rabbits ear. If the animal developed a fever, it conformed the presence of pyrogens,鲎变形细胞溶解物 19世纪70年代商业化，1977 FDA 批准 To obtain the lysate required for the LAL test, a small amount of horseshoe crabs blood is drawn Next, blood cells are separated and lysed to obtain the cellular proteins. 其检测原理不十分清楚，一般认为是变形细胞溶解物中的凝固酶原经内毒素激活转化成具有活性的凝固酶。在凝固酶的作用下，变性细胞中的凝固蛋白原转变成凝固蛋白，凝固蛋白相互聚合形成凝胶。,内毒素和外毒素基本特性比较,内毒素和外毒素基本特性比较,第二节 细菌毒素的作用机制,细菌毒素一般至少有两个功能区：一是靶细胞膜受体结合区，决定毒素对靶细胞的特异性并介导毒素进入细胞；另一个是活性区，它选择“靶点”，决定毒力强弱和作用机制，具有膜穿孔或酶活性，并引起相应临床症状。,细菌毒素的特定作用对象为“靶点”，它可以是某种细胞、细胞器、酶或其他大分子物质。 毒素要发挥毒性作用，需经以下步骤： 1毒素结合区与敏感细胞的相应膜受体结合； 2 毒素进入细胞或毒素信号导入细胞； 3 毒素到达靶点； 4 毒素激活、修饰或改变靶点。,一 毒素进入靶细胞的一般机制,（一）毒素与靶细胞膜受体结合 细菌毒素与靶细胞膜上相应受体结合是发挥毒性作用的第一步。毒素引起宿主何种临床症状，首先取决于细菌的定植部位及毒素受体。 毒素受体是一类能与相应毒素特异结合，并能介导毒素（或毒素信号）进入细胞内的膜分子，如蛋白质、糖蛋白、胆固醇等。受体应具有以下特点：1）特异性：受体与毒素有高度对应性；2）高亲和性：受体与毒素结合能力较强，一般是分子空间构象互补吻合，具有不可逆性。当然，也有低亲和性受体；3）效应性：受体能介导毒素内在化，或传递毒素信息。 细菌毒素只有1个受体结合区，故1个毒素分子一般只与1个受体分子结合。,（二）细菌毒素的入胞及转运机制 入胞方式 细菌毒素与膜受体特异结合后，可通过以下方式进入细胞： 1 穿膜进入 2 跨膜控制：具有跨膜控制方式的毒素与膜受体结合后，不进入细胞内，而是通过受体分子构型的改变，引起细胞表面调节装置改变或激活膜内镶嵌的酶分子，将毒素携带的生物信号传递至细胞内，进而调控细胞内的相关代谢反应。 3 内在化（internalization）是指细菌毒素与相应受体结合后，依靠受体介导的内吞作用（receptor mediated endocytosisi, RME）进入细胞。几乎所有的真核细胞膜上都有一种特殊的“内吞细胞器”，称为膜小泡(coated vesicles),二 溶细胞机制,（一）聚合型穿孔毒素 这类毒素至少存在两种聚合方式：1单体分子在靶细胞膜外侧上或在液相中形成聚合体，之后插入细胞膜导致细胞溶解；2 一个单体分子先行插入细胞膜内，随后若干个单体分子紧随其后依次插入，排列成中空的跨膜聚合体，导致细胞溶解。 （二）RTX家族 分为；1 特异性RTX，靶细胞范围广泛；2 高特异性RTX,三 酶活性机制,许多细菌毒素，如霍乱肠毒素、白喉毒素等等具有酶活： （一）ADPR转移酶 腺苷二磷酸核糖转移酶的A链一般具有两种酶活性，即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸糖基水解酶和ADPR转移酶，前者将NAD糖基水解为ADPR和尼克酰胺，后者则将ADPR转移到一个受体分子上。 （二）葡萄糖基转移酶 （三）脱嘌呤酶 （四）脱酰胺酶 （五）锌内肽酶 （六）腺苷环化酶,第四节 超抗原,超抗原（superantigen, SAg）的概念最早由White于1989年提出，它是一类具有多种免疫活性的蛋白分子，由某些细菌、病毒、支原体等产生。,一 特点,与普通抗原（conventional antigen）相比，细菌毒素超抗原应具有以下显著特点： 1 只需极低浓度（1-10ng/mL）即可刺激强烈的初次免疫应答，可激活的T淋巴细胞的数量比普通抗原多达103-105倍，且没有初次和再次免疫应答的区别，故称为超抗原。而普通抗原必须在体内引导和加强后，才能在体外检测到T细胞增殖反应。,2 不经抗原提呈细胞（antigen presenting cells, APC）加工处理，可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHC -类分子及T细胞受体Vb区特异性结合，激活T细胞增殖。而普通抗原则需经APC降解成短肽后，才能提呈于MHC 类分子肽链结合的沟槽内。,3 结合部位不在抗原肽结合的沟槽内，而在沟槽外侧。具有双结合功能，能同时与APC膜上的MHC-a/b链及T细胞膜上的TCR-b链可变区（Vb）结合。 4 与TCR结合时，只涉及TCR Vb的抗原受体互补决定区CDR2和CDR1,不涉及Vb的CDR3和TCRa的识别，故T细胞对超抗原的反应不受MHC-类分子的限制，这违背MHC限制的“黄金规则”。普通抗原特异性细胞反应都受MHC限制。,二 分类,超抗原(SAg)由某些细菌、病毒和支原体产生，可分为,三 诱导免疫应答机制,（一）激活MHC表达细胞 超抗原不需要抗原提呈细胞的加工处理，但在大多数情况下，依赖于MHC类分子的提呈。 （二）激活T细胞 SAg与MHC 类分子结合后，由APC提呈直接与TCR-Vb连接，由于连接位点在抗原结合沟外侧，因而这一过程不受TCR:MHC及CD4:MHC反应的限制。SAg活化T细胞时，不像普通抗原同时受TCRVa-Ja和Vb-Db-Jb多重限制，他们只与TCR-Vb结合。,由于人TCR-Vb的基因只有20余种，而一种SAg一般可选择地与几种TCR-Vb分子相互作用，因此，SAg可激活大量的T细胞，即激活T细胞的百分比显著增加，大约占T细胞的10-30%，比普通抗原高出数百倍以上。由于SAg具有强大的T细胞激活功能，可为抗肿瘤的靶向治疗和疫苗佐剂研制提供新的思路。 （三）对B细胞的影响 SAg对B细胞可产生显著影响，因为B细胞表达MHC 类分子，可作为SAg提呈细胞。超抗原不能单独引起高度纯化B细胞的增生和分化成为抗体生成细胞，但在T细胞存在下，可诱导B细胞增殖，并促进其分化成为浆细胞，产生抗体。,四 生物学效应,超抗原作为一类强大的免疫激活因子，可活化T细胞和抗原提呈细胞，其作用范围从T细胞增殖的诱导，众多细胞因子释放，免疫抑制到免疫耐受和免疫无反应性。细菌毒素超抗原的生物学效应主要表现在2个方面： 对免疫系统的直接效应 SAg可以超常量激活T细胞和MHC表达细胞，由于T细胞被大量激活后，随之出现凋亡，T细胞数量减少，必然使宿主免疫功能下降，继发免疫抑制。此外，SAg还可能大量激活自身反应性T细胞或B细胞，有些B细胞可以持续地多克隆增殖分化，产生自身抗体，因而引起自身免疫病。,由细胞因子介导的间接效应 SAg超常量激活T细胞和MHC表达细胞，使它们分泌过量的细胞因子，尤其是IL-1、IL-2、IL-6、TNF和IFN- 等，导致免疫系统严重紊乱，往往对机体产生毒性效应，如体温升高，炎性细胞浸润，血管内皮细胞或其他细胞损伤，释放生物活性介质，渗透压平衡失调，增加机体对内毒素及其它毒素的敏感型等。因此，SAg与毒性休克综合症、类风湿关节炎、川崎综合症、食物中毒、婴儿突然死亡综合症、猩红热、银屑病等都有密切关系。,第五节 脂多糖,脂多糖(LPS)主要毒性成分脂质A与内毒素受体相互作用后，可诱导前炎症细胞因子系统而介导细胞毒反应，最终导致内毒素休克甚至多器官功能障碍综合征，病死率高达50%以上。,一 分子结构特点 LPS由O-特异性多糖主糖链（O-specific polysaccharide chain）、核心多糖(core oligosaccharide)和脂质A或类脂A(lipid A)通过共价键依此连接而成。,O-特异性多糖主糖链 由0-50个寡糖重复单位构成，每个重复单位含3-6个单糖分子。单糖种类有戊糖、氨基戊糖、己糖、氨基己糖、脱氧己糖等。O-特异性多糖主糖链变异性最大，如沙门菌A、B、D和E血清群的O-多糖链由“甘露糖-鼠李糖-半乳糖”三糖重复单位组成，C2群的纽波特沙门菌则由“鼠李糖-甘露糖-甘露糖-半乳糖”四糖单位组成。沙门菌A、B、D和E血清群主糖链相同，但支糖链不同。因此，单糖的种类、数目、排列顺序和糖链的空间构象等构成了细菌的O抗原决定簇,核心多糖 位于O-特异性多糖主糖链与脂质A之间，有外核和内核组成。外核由3个己糖构成糖链骨架，此骨架因菌而异。 脂质A 是LPS分子中最保守的部分，基本骨架由2个D-氨基葡萄糖以b-1，6糖苷键连接合成。,二 LPS受体及入胞方式 病原微生物侵入人体后，先天免疫系统的各种细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、粘膜上皮细胞、抗原提呈细胞等依靠一组“模式识别受体”（pattern recognition receptors, PRRs），如CD14、Toll样受体（Toll-likereceptors, TLRs）、b2-整合素（b-intergrins, CD11/CD18）、巨噬细胞清道夫受体(macrophage scavenger receptors)、补体受体CR1/CR2等识别“病原体相关分子模式”（pathogen-associated molecular patterns,PAMAs）。PAMPs包括革兰阴性菌的脂多糖（LPS）和脂蛋白，革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸等。免疫细胞最重要的PRRs是CD14和TLRs。一旦PRR识别某一PAMPs后，这些效应细胞立即发挥作用。,LPS受体 LPS与宿主细胞的结合方式有2种：1）非特异性结合：LPS的脂质A通过亲脂性的疏水作用与细胞膜磷脂结合，从而改变磷脂膜结构的物理化学性质（如膜完整性、流动性、膜电势等），产生相应信号转膜传导，影响细胞的状态和功能；2）特异性结合：LPS通过脂质A与相应膜受体特异性结合。LPS的膜受体有多种，比较肯定的CD14。,入胞方式 LPS可能以两种方式进入细胞：1）聚集的LPS或整个细菌与mCD14(膜CD14)结合，然后内吞进入细胞，并被运送至溶酶体内，最终被溶酶体酶降解；2）LBP (一种由肝细胞合成的急性期血清糖蛋白)催化LPS单体分子与s/mCD14结合，然后以LPS-LBP-mCD14复合物的形式内在化进入细胞，最终聚集在高尔基体内。,三 LPS信号转导途径IkB/NF-kB系统 Toll 样受体 1988年，Hashimoto等发现在果蝇细胞膜上有一种属于类跨膜蛋白的受体，称为Toll受体。后来发现从昆虫到人都有氨基酸序列同源性极高的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族，该家族成员属于先天免疫系统，参与非特异性免疫防御的各种细胞精确识别病原体相关分子。目前已确定了十几种人类TLR的编码基因，研究较多的是TLR4和TLR2 TLRs主要表达在感染早期直接接触微生物的细胞，如单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肠上皮细胞以及内皮细胞等细胞膜上，是病原微生物跨膜信号转导的重要受体。目前认为TLRs可能启动多条信号转导途径，其中最重要的核转录因子-kB（nuclear factor, NF- kB）途径。,NF- kB 在细胞内，存在着一个调控基因转录的IkB/NF-kB系统。NF-kB，对许多基因，包括免疫防御、炎症和凋亡过程的基因表达起着中心调控作用。已发现5种NF-kB蛋白，在所有NF-kB蛋白N末端都有1个高度保守的Rel同源区(RHD), NF-kB分子通常依靠RHD连接形成二聚体分子，其RHD区结合有DNA和抑制蛋白IkBs。,LPS激活TLR4的信号途径 Toll样受体是LPS跨膜信号转导的辅助受体。在MyD88依赖性信号转导途径中，G-菌释放的LPS在血流中与LBP结合形成复合物，然后与单核细胞和巨噬细胞表面的mCD14结合，LPS、LBP和CD14三者相互作用，导致TLR4同型二聚体的胞内TIR区发生构象变化，从而能募集并激活接头蛋白MyD88，从而触发细胞信号级联反应。首先，由MyD88与IL-1受体相关激酶(IRAK)的N死亡结构域结合而导致IRAK自动磷酸化，激活的IRAK从受体复合物解离，继而激活TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6），由后者再激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK）。,该激酶激活后，可激活NF-kB诱导激酶（NF-kB inducible, NIK）,继而活化IkB激酶（IkB kinase, IkK)复合物。活化的IkK将IkB磷酸化，随后磷酸化的IkB被一种26S的蛋白酶降解，NF-kB被解除抑制，游离释放，并移位进入细胞核内，与kB基序结合(kB motif)结合，启动基因转录，发挥调控作用，诱发一系列免疫炎症反应。 TLRs及其胞内信号传递分子的发现，将有助于阐明LPS介导的信号转导机制，为治疗内毒素休克这一致死性的临床综合征提供新的思路。,四 LPS生物学效应 NF-kB调控的靶基因大致有以下几种： 参与炎症和早期防御的基因 所编码的主要产物有：1）前炎症细胞因子，如TNF-a、GM-CSF、IL-1/-2/-6/-12；2）细胞黏附分子，如细胞间粘附分子；3）急性期蛋白；4）诱导酶；5）抗菌多肽，如b-防御素(b-defensins)。这些产物直接参与炎症反应和非特异性抗菌反应，也诱导协同刺激分子CD80的表达。,参与特异性免疫的基因 主要包括 MHC、IL-2/12、IFN-g、协同刺激分子CD80、CD86的编码基因。这些基因产物可协同激活特异性免疫细胞，并参与调控特异性免疫应答。 编码影响细胞凋亡的关键性蛋白的基因 如c-IAP-1/-2、Fas配体、c-myc、p53等的编码基因，这些产物可启动细胞凋亡过程。 可见，LPS一般不直接损伤各种组织器官的细胞，而是通过刺激参与先天免疫防御的各种免疫细胞和内皮/粘膜细胞，诱导产生各种细胞因子、炎症因子、急性期蛋白、活性氧/氮分子、抗菌多肽，以及激活特异性免疫细胞，引起各种组织器官以及全身性多种病理生理反应。,第六节 细菌毒素在医学上的应用,细菌毒素可用于制备疫苗或抗毒素等生物制品，以预防或治疗相应毒素中毒症。细菌毒素对靶位具有高度选择性、高效性，因此，可广泛应用于细胞生物学（毒素内在化的路径及其与细胞器的相互作用、越膜信号、G蛋白）、神经生物学（神经介质的释放、与突触囊泡的相互作用）、免疫学（单克隆抗体、细胞因子）、药理学(炎症因子的释放)。有目的地选择细胞特异受体或胞膜分子，可设计新的以天然、合成或重组毒素为基础的免疫原作为疫苗和有效药物或潜在的抗肿瘤或抗病毒疗法,一 药 物 厌氧芽孢梭菌属细菌能产生很多毒素，统称为梭菌毒素，其中许多可能用作临床药物。肉毒毒素A (BoNT-A)有限制地用于临床治疗许多痉挛性病症和痛症，如不随意肌（胃、肠、血管、心肌等）痉挛、张力障碍、局部肌肉痉挛、肌痉膜痛等，特别是治疗麻痹性斜视、紧张性头痛和偏头痛较为成功。,二 免疫调节 LPS可以活化单核-巨噬细胞等，分泌多种细胞因子，增强宿主的非特异性免疫功能。,三 免疫毒素 免疫毒素(immunotoxins，Its)是人工制备的导向疗法生物制品，由选择特定靶细胞的定位部分（导向载