器官移植配型.ppt

器官移植配型理论与技术,1,基本概念,广义的器官移植：用自身或异体的正常器官、组织或细胞置换病变或功能缺失的器官、组织或细胞，以维持和重建机体的生理功能。 影响移植成功的关键因素是可能发生的免疫排斥反应；,2,一. 基本概念,人,人,猪,相关概念,同种异体移植,异种移植,同系移植,移植,自体移植,3,引起排斥反应的抗原,ABO血型抗原； 组织特异性抗原； 主要组织相容性抗原(MHA, major histocompatibility antigen )，又称人类白细胞抗原（HLA）; 次要组织相容性抗原（mHA, minor histocompatibility antigen ）H-Y抗原;,4,HLA的基因结构、抗原结构及特点,由第6号染色体短臂21.31区编码，按功能分为HLA-I,三个区域，其中I,区编码抗原与移植关系密切。,HLA-I类抗原主要由A、B、C位点编码； HLA-类抗原由DR、DP、DQ位点编码；,5,HLA-I类抗原是由第6号染色体相应I类基因编码的链与第15号染色体编码的2微球蛋白非共价键结合的糖蛋白，主要表达在有核细胞表面； HLA-类抗原由第6号染色体相应类基因编码的链和链非共价键结合的糖蛋白，主要表达在抗原递呈细胞，胸腺上皮细胞表面；,6,HLA抗原的生物学功能,1.参与蛋白质抗原的处理与递呈； 2.调节免疫应答； 3.参与T细胞分化过程； 4.介导同种免疫应答；,7,HLA基因的遗传特点,1.高度多态性；HLA基因呈现多位点复等位的特点； 2.共显性遗传：每对等位基因同时表达； 3.单倍型遗传：位于同一条染色体上的 HLA各位点的基因组合； 4.连锁不平衡：单倍型基因非随机分布的现象；,8,2.传统的HLA分型技术,血清学分型:补体依赖的细胞毒实验; 待测淋巴细胞与已知抗体孵育，再加入补体，若该抗体与淋巴细胞膜上HLA分子相匹配，则激活补体系统导致待测细胞膜的破坏，否则细胞膜完整不受影响。 局限性：需要活的淋巴细胞；存在交叉反应；隐蔽抗原无法识别；人为影响因素多质控难做；,9,细胞学分型：混合淋巴细胞培养技术； 受者淋巴细胞与已知类型的淋巴细胞或者供者淋巴细胞混合培养，两种细胞HLA分子表型如果相同则不能刺激淋巴细胞增殖，反之则刺激淋巴细胞增殖，分为单双向两种类型。 局限性：需要活的纯合子表型的淋巴细胞；增殖检测方法要用到同位素；,10,分子生物学技术分型,HLA抗原蛋白分子的多态性取决于相应编码基因的多态性； RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP; PCR-SSCP; PCR-Sequencing； PCR-SSO/基因芯片技术； 流式细胞仪技术； 氨基酸残基配型标准分析技术；,11,聚合酶链反应（PCR） 在多聚合酶，引物，底物和模板的参与下通过变性，退火，延伸三个循环步骤在短时间内达到对目的片断的大量扩增，是基因 分型的基础。,12,2019/10/26,13,RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/ 基因组DNA 提取 酶切 电泳分析（RFLP） DNA 扩增（共性引物/特异性引物） (限制性内切酶酶切) 电泳检测(PCR-RFLP/PCR-SSP),14,PCR-SSCP（单链构象多态性）,提取基因组DNA PCR扩增（特异引物） 变性(双链 单链) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据带型可检出基因的多态性又可检出点突变，有利于发现新的等位基因,15,PCR-sequencing,提取基因组DNA PCR扩增（非特异/特异引物）DNA测序 最可靠、直接、准确的HLA分型方法； 临床上应用限制了供体的来源； 在确定等位基因的多态性、发现新位点、基因定位等研究领域应用较多；,16,PCR-SSO（序列特异性寡核苷酸探针杂交）/基因芯片技术,正向杂交：提取基因组DNA PCR扩增（共性引物） 将PCR产物固定在固相支持载体上并进行变性处理 与标记的特异性寡核苷酸探针变性杂交 根据杂交信号判断HLA类型； 反向杂交：将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体上 与标记的PCR产物（已经变性处理）杂交 根据杂交信号判断HLA类型； 基因芯片技术是一种反向PCR-SSO方法，具有高通量、缩微化、自动化程度高、准确性高等优势；,17,流式细胞仪技术,提取基因组DNA 非特异性PCR扩增 变性处理 与包被了特异性HLA探针的微球结合 洗脱处理 通过流式细胞仪检测 利用流式细胞仪技术将反向的固相PCRSSO技术变为液相检测分析技术； 每种包被了不同类型HLADNA探针的微球对应一种荧光染色能够被流式细胞仪识别； 具有高通量、准确快速的优势；,18,氨基酸残基配型标准分型技术,根据HLA分子346个氨基酸残基中对移植物排斥与存活率具有重要影响的关键氨基酸，当供受者的关键氨基酸残基相同，尽管接受HLA抗原部分错配的供体，产生的免疫反应性仍然是低反应性或无免疫反应性，从而使移植物得以长期存活。,19,HLA分型技术临床应用评价,1.在器官移植中具有重要临床意义； 六位点配型原则：HLA-A/B/DR 2.合理选择HLA基因分型技术； 各种方法相互补充，难以相互替代，根 据不同需求选择不同方法,20,抗原法/基因法,21,字母HLA代表染色体上一段特殊的遗传区域（人类白细胞表面抗原区域）； A/B/DR代表该区域某一具体的基因座位； 数字代表该基因座位编码的特异性抗原（血清型）