化学致畸作用与发育毒性.ppt

化学致畸作用与发育毒性 （Chemical Teratogenesis and Developmental Toxicity ）,1,2,概 述,3,一、发育毒理学(Developmental Toxicology),研究出生前化学物和环境暴露导致异常发育结局、有关作用机制、影响因素和药动学等。 是毒理学的重要分支学科,4,先天缺陷与环境的关系,1940年澳大利亚风疹大流行次年出生的婴儿先天性白内障、耳聋、智力不全和先心病发病率升高 1945年日本原子弹核辐射胎儿出生后小头畸形、智力低下，一年内死亡率达到25% 反应停（thalidomide）事件短肢畸形 1970年，胎儿酒精综合症面部畸形、生长迟缓、精神运动和智力发育障碍 孕期吸烟自然流产、围生期死亡、婴儿猝死综合症、学习和行为及注意力障碍等。,5,Brent 和Beckman（1990） 将人类出生缺陷进行分类,15-25% 遗传 4% 母体状况 3% 母体感染 1-2% 畸形（如由于脐带所致的肢切除等机械问题） 1% 化学因素或其它环境因素 65% 未知的病因,6,化学品对生殖发育的损害,妊娠母体 带有致畸因子的雄性 作用于胚胎的器官形成期形态畸形 妊娠前期不育 胎期出生后表现 综合考虑对母体和父体的影响，将形态致畸与神经行为发育毒性结合起来进行观察，将生殖毒性和发育毒性结合起来进行研究,7,第一节 生育毒性与发育毒性,8,有害因素,亲代生殖功能生殖毒性 研究外源化学物对亲代生殖功能的有害作用 子代发育过程发育毒性 研究外源化学物对子代生殖功能的有害作用,9,子代断乳到性成熟：暴露于外源化学物，与急性毒性、慢性毒性实验相似 常规的发育毒性试验：强调经亲代（尤其是母体）暴露后表现的子代发育毒效应,10,A. 从交配前到受孕 （成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精） B. 从受孕到着床 （成年雌性生殖功能、着床前发育、着床） C. 从着床到硬腭闭合 （成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成） D. 从硬腭闭合到妊娠终止 （成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长） E. 从出生到离乳 （成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长） F. 从离乳到性成熟 （离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）,11,相关术语,孕体(conceptus) 胚胎(embryofetus)：胚体(embryo)、胎体(etus) 幼体（仔体，pup） 成体(adult) 母体(maternal) 父体(paternal) 亲代(paternal generation) 子代(offspring) 窝(litter),12,13,14,在出生前暴露，个体发育为成体之前诱发的任何有害影响，包括在胚期和胎期诱发或显示的影响，以及在出生后显示的影响。 发育生物体死亡 生长改变/迟缓 功能缺陷:出生后较长时间诊断 结构异常,发育毒性,15,生殖和发育毒性的特点及靶器官,亲性腺作用: 影响生殖器官的发育和成熟，或造成病理性改变。 固醇类药物、化疗药物、有机磷农药、重金属等 亲胚胎毒性：胚胎体细胞突变，不具有遗传性。 EDTA 氨基蝶呤 亲胎盘作用：影响胎盘血供，干扰胎盘功能 5-HT、甲基汞 胎盘致癌：己烯雌酚,16,生殖发育毒性特点,生殖过程较机体的其它系统或功能对某些化学物的毒作用更为敏感，在成体系统的NOAEL，胚胎即可受到影响 损害不仅表现在暴露化学物的机体本身，还可能影响其后代,17,第二节 发育毒理学原理和作用模式,18,致畸关键易感期及其它影响因素,致畸敏感期 遗传类型 化学物的剂量 母体因素和母体毒性 其它因素,19,致畸敏感期,器官形成期 细胞分裂极旺盛的时期，迅速改变细胞分裂速度，增加突变的可能性，对畸形产生极为重要 靶窗（target windows） 各器官对致畸作用的特殊敏感期,20,6-15天,6-18天,21,22,23,遗传类型,物种差异 因代谢变化、胎盘种类、胚胎发育速度和方式引起 对致畸物的易感性取决于机体的基因型 畸形仅发生在那些形成活化代谢物的物种中 反应停：对大、小鼠无致畸作用； 对人有极强的致畸作用 （人、猴、兔能将其代谢产生活性中间产物） 一种化学物在不同物种中的致畸作用可以是不一致的（啮齿类和非啮齿类，假阴性),24,化学物剂量,阈剂量 典型的致畸作用：剂量-反应曲线斜率很大，从NOAEL到胚胎100%死亡剂量只差2-4倍 致畸带：从NOAEL到引起胚胎死亡剂量 剂量过低，致畸作用表现不出来 剂量过高，胚胎大量死亡，畸胎数减少，畸胎率下降或对母体毒性（直接作用/继发作用）,25,母体因素和母体毒性,母体毒性 发育毒性 影响发育的母体因素：遗传、疾病、营养、应激 一般认为胚胎死亡和生长迟缓是母体中毒剂量水平引起的胚胎毒性表现，但是先天畸形是否继发于母体毒性还有争论 腭裂,特异（直接）,非特异（间接）,26,准确描述间接的母体毒性与直接的胚体/胎体之间的关系仍然很难,27,其它因素,化学物的理化性质 分子量小、极性低、脂溶性高、未与母体血浆蛋白结合，易通过血脑屏障，到达胚胎体内 染毒途径 大鼠经口GD7-14给予EDTA，70%胎鼠畸形；皮下注射，对母体毒性增加，未见明显的胎鼠畸形,28,化学致畸物作用的剂量-反应关系,在化学物的胚胎毒作用中，功能缺失和经胎盘致癌要到成年以后才显示。 出生时检测的胚、胎毒性只有胚胎死亡、畸形、生长迟缓。 器官形成期一次染毒，剂量水平不导致母体严重毒性条件：,29,1在不引起胚胎死亡的剂量水平，可导致整窝胚胎发生畸形（表明该化学物有高度致畸性，较少见）,（一）致畸作用及其它胚胎毒性的剂量-反应模式,30,2化学物在胚胎毒剂量范围内导致在一窝中同时存在胚胎吸收或畸形、生长迟缓和正常胚胎（细胞毒性致畸物，较常见）,31,3只有生长迟缓和胚胎死亡，没有畸形（非特异性胚胎毒物，对胚胎致死性的，非致畸物，在生长迟缓和胚胎死亡剂量之间做进一步研究，以确定致畸作用是否被胚胎致死效应掩盖）,32,某些化学物的胚胎致死及致畸效应是同一种原发性作用，不同程度的表现（B型反应谱） 化学物作用上存在质的不同，导致胚胎死亡（C型反应谱），导致畸形（A 型反应谱） 对于一个未知胚胎毒性的化学物，应进行三阶段实验,33,发育毒性的作用机制,个体发育过程经历了胚胎细胞增殖、凋亡、分化、识别、迁移和功能表达，以及组织和器官的形成等发育事件 胚胎的发育，具有复杂和精密的规律，有精细的时间顺序和空间关系 特异性或非特异性地影响发育事件，都可能引起畸形或其它发育毒性,34,与核酸的交互作用 干扰核酸复制，转录或RNA翻译 能量供应和渗透压的改变影响机体能量供应、缺氧等 代谢酶的抑制 抑制核苷酸合成，干扰细胞分化或生长 氧化应激脂质过氧化、蛋白质氧化和降解 其它许多致畸物作用模式尚未知,35,36,37,38,哺乳和毒物,39,第三节 生殖与发育毒性试验,40,动物选择,必须以哺乳动物为实验对象 一般要求与其它毒理学研究相同的物种与品系 首选啮齿类大鼠 在胚胎-胎仔发育毒性试验中，需要用两种哺乳动物，非啮齿类动物，首选兔,41,2019/10/27,42,受试物暴露剂量,依据已有的药理学、毒理学相关资料选择 高剂量：产生轻微的母体毒性 低剂量：无毒作用 中剂量：最小的毒作用 大多数情况下，最高限量为1g/kg/d,43,受试物暴露,途径与频率 与人的暴露途径相同 一般一日一次，每天在相同时间染毒，并根据体重调整染毒剂量 对照组 与实验组相同的最大容量的赋形剂组 如赋形剂组可能有不良影响，增设空白对照组,44,三段生殖毒性试验,45,各个生殖阶段之间不得有空隙，三个关联阶段，受试物暴露时期至少有1天的重叠 生育力与早期胚胎毒性试验（一般生殖毒性试验） 胚胎-胎仔发育毒性试验（致畸试验） 出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验） 三段的划分是按有害作用的诱发时期，不考虑检测的时间,46,47,生育力与早期胚胎毒性试验,48,对雌雄动物由交配前到交配期直至胚胎着床给药，以评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用 对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、生育力、受精、着床前的发育和着床的影响 至少一种，首选大鼠，16-20窝/性别/组 一般情况下，雄性动物连续给药410周后进行交配，交配期应连续给药至交配结束为止；雌性动物交配前给药2周（可覆盖至少两个完整的动情期），交配期和妊娠早期连续给药，至少应持续至胚胎着床（妊娠第67天）,49,动物处理 雄鼠交配前给药4-10周，雌鼠交配前给药2周，然后雌雄鼠11合笼，交配期为2周 观察到阴道涂片上的精子或阴栓即提示受孕，检出日为孕0天，次日为孕1天，以此推算孕龄。 雄鼠在证实交配并受孕成功后处死检查 雌鼠一般在孕中期第13-15天终止妊娠,50,观察和检查项目 一般状态观察 每天观察并记录动物的一般状况 体重变化 每周称重两次，详细记录体重增长情况 摄食量 每周称一次 (24h) 摄食量（交配期除外） 交配期间至少每日进行阴道涂片检查，以检查是否对交配或交配前时间有影响 交配能力 检查阴栓或雌鼠阴道内是否有精子作为大鼠的交配能力 生育能力 观察雌鼠是否能真实怀孕和生育能力,51,解剖检查 将雄鼠处死后解剖，观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器是否异常，对睾丸、前列腺、附睾等雄性生殖器官应称重并计算脏器系数，计数附睾中的精子数并进行精子活力检查。 在孕第1315天处死孕鼠后计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算着床数。 保存所有动物的睾丸、附睾或卵巢、子宫，必要时进行组织学检查。保存肉眼发现改变的脏器，以便进行可能的组织学评价，并保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。 对明显未孕的大鼠，可用硫化铵子宫染色鉴别有无胚胎着床前死亡。,52,胚胎-胎仔发育毒性试验,53,包括上述生育过程的C段至D段，评价药物（或受试物）对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响，评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎胎仔死亡、生长改变和结构变化。 试验通常采用两种动物，一种为啮齿类动物，一般用大鼠；另一种为非啮齿类动物，一般用家兔。 雌性应用性成熟的、未交配过的 妊娠动物数应满足数据分析的需要，通常大鼠不少于20只/组，家兔不少于12只/组。,54,给药期：自胚胎着床至硬腭闭合阶段给药，通常，大鼠为妊娠第615天给药，家兔为妊娠第618天给药。,55,除了设阴性对照组之外，应设阳性对照组 一般大小鼠可用乙酰水杨酸、环磷酰胺或维生素A（浓缩鱼肝油），兔可用6-氨基烟酰胺 阴性和阳性对照组的作用分别是为自发畸形的发生和该批实验动物在实验条件下的敏感性提供资料,56,观察和检查项目 一般状态观察 每天观察并记录动物的一般状况。 体重变化 每周称重两次，详细记录体重增长情况。 摄食量 每周称一次 (24h) 摄食量。 剖检所有成年动物，保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物相应器官以便比较。 胎鼠检查,57,围产期毒性试验,58,检测从胚胎着床到幼仔离乳这段时期给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和子代发育的不良影响，试验应持续观察至子代性成熟阶段。 该段试验的评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代死亡情况、生长发育的改变以及子代的功能缺陷，包括F1代的行为、性成熟和生殖功能。 至少采用一种动物，一般用大鼠，通常大鼠不少于20只/性别/组。,59,雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束，通常大鼠为妊娠第15天至离乳（出生后第21天）。 动物处理 雌性动物分娩后第4天调整每窝仔鼠数（一般为每窝8只，雌雄各半，其余淘汰），调整后的仔鼠饲养至离乳。 离乳后的子代，饲养至成年，分别进行行为试验和生殖功能评价。,60,观察和检查项目 一般状态观察 每天观察并记录动物的一般状况。 体重变化 每周称重两次，详细记录体重增长情况。 摄食量 每周称一次 (24h) 摄食量。 离乳后剖检所有成年动物 仔鼠检查,61,一代和多代生殖试验,62,食品添加剂、农药及环境污染物，反复暴露,63,各代雌鼠持续给药,64,第四节 人发育毒物的确定,65,生殖发育毒性的流行病学,流行病学对于生殖结局异常的研究目的主要有3个 寻找导致出生缺陷的原因 通过广泛地监督世界各国的出生缺陷登记，了解出生缺陷发生的趋势 引起公众注意并保护公众健康,66,人类发育毒物的确定,不能把动物实验结果轻易外推至人类 确认人类新的致畸物的标准如下：,67,动物实验结果与对人结果的一致性,预测能力最高的物种是小鼠（85%）和大鼠（80%），其次是兔（60%）和仓鼠（40%） 大鼠发育毒性的典型结果是出生前死亡、生长迟缓，再次是畸形 人、兔和猴中最常见的毒性是自发流产、胎体/新生儿死亡，其次是畸形，再次是生长停滞 如果不考虑发育反应的性质，与人类反应最接近的依次是大鼠（98%）、小鼠（91%）、仓鼠（85%）、猴（82%）、兔（77%）,68,69,致畸物及发育毒物的危险性评定,致畸指数：母体LD50/胎体最小致畸量 小于10：一般不致畸 10100：致畸 大于100：强致畸,70,化学物致畸潜力分类和安全系数确定,71,ICH人类用药危险性分类,72,美国FDA关于妊娠期和哺乳期用药 危险性分类,妊娠期用药 A:在妊娠人群中控制良好的研究未能证实有危险 B:在动物生殖试验中并未显示对胎儿的危险，但无孕妇的对照组，或对动物生殖试验显示有副反应( 较不育为轻) ，但在早孕妇女的对照组中并不能肯定其副反应( 并在中、晚期妊娠亦无危险的证据) 。 C:不能排除危险。缺乏人的研究，而动物研究缺乏或是阳性，但药物对患者的好处可能