纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰.pdf

第 4 4卷 2 0 1 6年 5月 分析化学 ( F E N X I HU A X U E ) 研究报告 C h i n e s e J o u r n a l o f An a l y t i c a l C h e mi s t 第5期 71 67 22 D OI ：1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 5 0 8 0 9 纳升液相色谱- 高分辨 串联质谱分析尿液多肽组 及 其翻译后修饰 洪晓愉 李水明 王 勇 ( 深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室 ， 深圳 5 1 8 0 6 0 ) 摘要多肽组是指生物体表达的所有多肽， 尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源。本研究采用氧 化石墨烯一 磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽 ， 进行纳升液相色谱一 高分辨串联质谱分析， 从单一样 本中鉴定了归属于 1 2 3个蛋白质的7 9 0条肽段。研究表明， 这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的。此 外， 本研究检测到了肽段的氧化、 磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象 ， 观察到了尿液多肽的阶梯序列性， 从蛋 白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析， 结果表明， 这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作 用 。本方法可为在尿液 中寻找疾病 的标志物提供方法学支持 。 关键词多肽组 ； 纳升液相色谱一 高分辨串联质谱 ； 尿液；翻译后修饰 1 引 言 随着基因组学、 转录组学和蛋 白质组学在生命科学领域 中的迅速发展 ， 多肽组 学的研究也逐渐 引起人们的关注 。从最简单的腔肠动物到最高等脊椎 动物 中， 大部分动物体 内都存在多肽 J 。多肽组 学的研究内容包括体液、 组织和细胞等生物体 内全部 内源性 多肽的组成 、 功能和变化规律 。有些多 肽作为蛋白质合成、 加工 、 降解的产物 J ， 可以反映机体 内蛋 白质 的异常代谢 过程 。蛋 白质被剪切成不 同的肽段后还可发挥特定的功能 。有些多肽作为生化信使分子 ， 如多肽激素、 神经多肽、 细胞因子、 酶抑制因子等 ， 组织调控机体内很多生理生化过程 ， 与疾病的产生有着密切的关系。作为蛋 白质组学的 延伸， 多肽组学技术能很好地监测到低分子量蛋 白质的变化。 在疾病生物标志物的筛选 、 疾病诊断、 疾病监测 、 疗效评价及预防等方面 ， 多肽组学也发挥了重要作 用 J 。尿液作为机体代谢的终端 ， 用于检测疾病的样本 时具有 可持续性和非侵袭性的优点 J 。表面增 强激光解吸 电离飞行时间质谱仪( S E L D I T O F MS ) 、 基质辅助激光解吸电离质谱 ( MA I D I T O F MS或者 M A I D I T O F T O F M S ) 以及 E S I 一 串联质谱仪， 例如三重四级杆质谱仪、 离子阱或者四级杆飞行时间质 谱仪 都可对多肽进行检测和分析。利用 MA I D I T O F MS ， 研究者在 胃癌、 乳腺癌 l 】 、 膀胱癌 ， I g A肾 病 等的早期诊断研究 中寻找到一些多肽生物标志物。但是此类方法在在寻找疾病差异多肽时 ， 重点 在于差异峰的比较 ， 不能准确鉴定蛋白质及其翻译后修饰。 氧化石墨烯 磷酸镧纳米磁性复合材料 ( L a G M) 是由石墨烯 、 L a P O 纳米棒和 F e ， 0 纳米粒子构成的 三重复合材料 ， 能够应用于低丰度多肽的快速富集 ， 如可有效富集尿液中的多肽 。本研究采用 L a G M 分离和富集尿液多肽， 采用纳升液相色谱一 串联高分辨飞行时间质谱仪鉴定多肽序列和翻译后修饰， 1 5 mL 尿样单一样本中鉴定出归属于 1 2 3种蛋 白质 的 7 9 0条肽段 ， 其 中有 9 1 条肽段带有氧化 、 磷酸化 和脱氨化翻译后修饰。本研究为利用尿液多肽组研究疾病生物标志物提供了快速高效的分析方法。 2 实验部分 2 1仪器与试剂 E k s i g e n t n a n o L C U lt r a T M 2 D二维纳升液相色谱系统、 T r i p l e T O F 5 6 0 0高分辨质谱仪、 P r o t e i n P i l o t 4 5 软件( A B S C I E X， 美 国) ； 真空冷冻干燥机、 超纯水仪( T h e r m o S c i e n t i fi c ， 美 国) ； C 反相色谱捕集柱 2 0 1 5 1 0 1 4收稿 ； 2 0 1 6 1 - 0 5接受 本文系国家。 自 科学基金项目( N o 3 1 4 7 0 8 0 4) ， 深圳市重点项 目( N 。 J S G G 2 0 1 4 0 7 0 3 1 6 3 8 3 8 7 9 3 ) 和深圳市 基础科学 布局项 目阿尔茨 海默症临床诊断研究( N o 基2 0 1 5 0 0 0 6 ) 资助 E ma i l ：wy o n g S Z U e d u e l l 第 5期 洪晓愉等：纳升液相色谱一 高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰 7 1 7 ( 1 0 0 p ,m3 e m， 3 m， 1 5 0 A， E k s i g e n t ， 美国) ； C 8 反相色谱分析柱( 7 5 m 1 5 e m， 3 m， 1 2 0 A， E k s i g e n t 美国) 。 L a G M按文献 1 3 方法 自行制备 ； 实验用水为超纯水 ； 纳升反相色谱流动相 A： 9 8 水 、 0 1 甲酸 和 2 乙腈 ， 纳升反相色谱流动相 B ： 2 水 、 0 1 甲酸 、 9 8 乙腈 。 2 2多肽的分离和富集 采集健康人尿液分装后于 0 保存 。取 1 5 m L尿液样 品， 1 0 0 0 0 r m i n离心 1 0 mi n后取上清液 ， 按照尿液与 3 0 m e , m L L a G M复合材料体积比为 5 0 ： 1混合 ， 充分涡旋 2 m i n后 ， 以 1 0 0 0 r mi n室温振荡 1 0 m i n ； 1 0 0 0 0 r m i n离心 5 m i n ， 磁分离 ， 弃上清液。在沉淀中加入 5 0 0 水 ， 充分涡旋 1 mi n ， 室温振荡 5 m i n ， 1 0 0 0 0 r m i n离心 5 m i n ， 磁分离 ， 弃上清液 ， 重复 2次。在沉淀 中加入 2 0 L洗脱液 ( 8 0 乙腈 1 三氟乙酸) ， 涡旋 l ra i n ， 室温振荡 5 m i n ， 1 0 0 0 0 r mi n离心 5 m i n ， 磁分离 ， 收集上清液， 重复 1 次 ； 上清 液冷冻干燥。 2 3 纳升液相色谱- T r i p l e T OF质谱分析 将磁性材料分 离后 冻 干 的多肽 样 品用 流动 相 A 溶解 。在 线 N a n o R P L C液 相色 谱 在 E k s i g e n t n a n o L C U l t r a 2 D系统进行 ， 样品以2 p L mi n的流速上样到 C 】 8 预柱上 ( 1 0 0 I mx 3 e m， 3 m， 1 5 0 A) ， 以 2 p L m i n流速冲洗脱盐 1 0 mi n 。分析柱为 c 反相色谱柱( 7 5 m 1 5 e m， 3 m， 1 2 0 A) ， 梯度洗脱 ： 0 4 2 mi n ， 5 2 5 B； 4 2 5 6 ra i n ， 2 5 4 0 B； 5 6 6 4 m i n ， 8 0 B； 6 4 7 0 m i n ， 5 B 。质谱分析 采用 T r i p l e T O F 5 6 0 0系统( A B S C I E X ) 结合纳升喷雾 I I I 离子源 ( A B S C I E X) ， 喷雾 电压 2 4 k V， 气帘气 压3 0 p s i ， 雾化气压 5 p s i ， 加热温度 1 5 0 C， 一级 T O F MS单张图谱扫描时间为 2 5 0 ms ， 每次 I D A循环下 最多采集 3 5个电荷为 2 + 8 + ， 且单秒计 数大于 1 0 0的二级 图谱 ， 每张二级图谱的累积时间为 8 0 m s 。 每次循环时间固定为 2 5 S ， 碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离 ( C I D) ， 动态排除设置 为 1 1 S 。 2 4数据 分析 采集到的质谱原始 w i ff图谱文件 ， 采用 P r o t e i n P i l o t S o f t w a r e v 4 5 ( A B S C I E X， U S A) 软件进行数 据加工处理和检索分析， 数据库为 u n i p r o t 库 中的 H o m o s a p i e n s 人种专一数据库 ( 包含 2 0 2 1 0条蛋 白质 序列 ， 2 0 1 5年 1月 2日下载 ) ， 检索参数设置为非酶切 、 磷 酸化强调和生物学修饰 ， 检索方式 为彻底分 析 ， 假阳性率控制为 1 F D R。 2 5 生物 信息 学分析 在 S t r i n g l O ( h t t p ： w w w s t r i n g d b o r #) 进行蛋白质相互作用网络图分析 ， S t ri n g 数据库是一个搜寻 已知蛋 白质之间和预测蛋 白质之间相互作用的系统 ， 这种相互作用既包括蛋 白质之间直接 的物理相互 作用 ， 也包括蛋 白质之间间接的功能的相关性 。蛋 白质聚类分析在 P A N T HE R( h t t p ： w w w p a n t h e r d b o r #) 上进行 ， P a n t h e r 是基于基因本体论对蛋白质进行分类 的数据库。 3 结果与讨论 3 1 尿液多肽组及其在蛋白质水平上的分析 本研究采用 纳升液相色谱 高分辨 串联 质谱分 析 ， 在 1 5 m L尿样 中共鉴定到 7 9 0条特异性多肽 ， 其中序列相 同、 修饰不同的肽段视为不 同的肽段 ， 这 些肽段的分子量分布在 9 6 0 6 5 0 0， 理论上等 电点分 布在 3 7 7一l 4 3 8 ( 图 1 ) ， 肽段电荷数 2 7 。在不考 虑修饰的情况下 ， 鉴定到的特异性肽段有 7 2 1条 ， 即 至少在 6 9条肽段上发生一种或多种修饰 。这些肽 段在蛋白水平上 归属 于 1 2 3种蛋 白质 ， 9 5 置 信度 下这些蛋白质的覆盖率为 0 7 5 9 3 8 8 ， 然而这 些肽段在蛋 白质水平分 布并 不平均， 搜库得分排位 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 Th e o r e t i c a l p I 图 1 尿液多肽的理论等电点及分子量 F i g 1 T h e o r e t i c a l i s o e l e c t r i c p o i n t( P I )a n d mo l e c u l a r w e i g h t o f u r i n e p e p t i d e s 享 舅_【 j 0 0 0 菩 7 1 8 分 析 化 学 第 4 4卷 前 1 0位的蛋 白质 占5 0 8 8 ， 而排位后 2 3位的蛋 白质都各有一条肽段被鉴定 ， 在 3 3种蛋 白的肽段 中鉴 定到翻译后修饰 。例如在抗胰蛋 白酶的 9 4条肽段中有 1 7条 肽段发生翻译后修饰 ， 尿液中常见蛋 白分 泌型尿调节蛋 白鉴定到的 4 0条肽段中有 1 4条发生修饰。排名前 2 5位蛋 白质的总肽段数 目和翻译后 修饰数 目如表 1所示 ， 翻译后修饰 的肽段数与鉴定到的肽段总数之间并没有 明显的正相关性。 表 1 得分前 2 5 名的蛋白质的肽段数及其翻译后修饰的肽段数 T a b l e 1 N u m b e r o f p e p t i d e s a n d p o s t t r a n s l a t i o n mo d i f i e d p e p t i d e s( P T Ms)o f t h e t o p 2 5 p r o t e i n s 3 2翻译 后修 饰 的类 型 本研究共检测到6 种主要 的翻译后 修饰 ， 即脱氨 、 N 端焦谷氨酸化 、 N 端 乙酰化 、 氨基酸残 基氧化 、 双氧化和磷酸化( 表 2 ) 。其 中发生脱氨反应的 共有 4 4条肽段 ， 主要发生在谷氨酰胺和天冬酰 胺两种氨基酸上 ， 发 生在谷 氨酰胺 上 的有 2 8 条 ， 而天冬酰胺上 的有 1 6条 ； 发生氧化修饰 的 共有 2 3 条， 其中发生在脯氨酸上的有 7条， 在 甲硫氨酸上的有 1 5 条( 表3 ) ， 发生在天冬氨酸 上的有 1 条。值得指出的是， 肽段发生脯氨酸 位点的氧化修饰时， 常是多个脯氨酸的位点发 生氧化修饰； 而肽段发生甲硫氨酸位点的氧化 修饰时， 则只有一个甲硫氨酸的位点被氧化。 甲硫氨酸残基的氧化常与疾病密切相关 ， 蛋 白 表 2 尿液多肽的翻译后修饰类型及对应的肽段数 目 T a b l e 2 S t y l e s o f P TM a n d i t s n u mb e r o f p e p t i d e s o f u r i n e p e pt i de s 质的甲硫氨酸残基能够被 多种类 型的活性氧 ( R O S ) 氧化 ，生成 S构 型的蛋 氨酸亚砜 ( M e t _ S ( O) ) 和 第 5期 洪晓愉等： 纳升液相色谱一 高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰 7 1 9 R构型的蛋氨酸亚砜( Me t - R( O) ) ， 导致蛋 白功能的降低或丧失 。蛋 白质 甲硫氨酸的氧化 与衰老相关 的疾病密切相关 ， 例如帕金森病 。此外 ， 本研究还鉴定到7条磷酸化修饰肽段 。 表 3 发生 甲硫氨酸氧化 的肽段 T a b l e 3 P e p t i d e s w i t h me t h i o n i n e o x i d a t i o n 蛋 白序列号 Ac c e s s i o n 蛋 白名称 Na me 序列及翻译后修饰 S e q u e n c e a n d FF M P O 1 0 0 9 1抗胰蛋 白酶 一1 一 a n t i t r y p s i n D I T D G N S E H L K RE H S L I K P Y QG V G S S S MP L WD F QG S T VL S P ADKTNVKAAW GKVGAHAGEYGAEAL ER M NL K H RL E D ME Q A L S P S V F K A I M E KL E MS K F Q P T DKT NVKAAW GKVGAHAGEYGAEAL ER M L M ! E Q N T K S P L F E 9 P G N 7 浆 蛋 白 孽c 固 子 F E S F G D L S T P D A V N P K v K A H G K K v L G A F s D G L A H L D N T JK G f la s m a p ro Le a s e 1 ln fl ln lio I 一 一 曼 r R P r L _M ! 9 ! 曼 一 一 P 6 R R 7 1 血红蛋白亚基卢 L MI E Q N T K s P L F G K V V N P T Q K 一 He mo g l o b i n s u b u n i t B MI E Q N T K S P L F MG K VV N P T Q K D6RBV2 P O 51 5 4 Q1 5 9 0 4 血红蛋 白亚基 S F GD L S T P D AVMGNPKVKAHGKKVL GAFS DGL AHL DNLKG He m o g l o b i n su b u n i t ! I R L P Y TA S S G L 皇 曼 曼 璺 9 曼 Q 曼 孚 9 垒 垒 曼 一 v i 鬻 慧 3 6 v IE Q N T L F M G K V V N P T Q K 血浆丝氨酸蛋白酶抑制 因子 P l a s ma s e r i n e p r o t e a s e i n h i b i t o r V型质子 AT P酶 s 1亚基 V- t y pe p r o t o n AT P a s e s u b u n i t S1 F S AMKKVE TN MAF S P F S M I E Q N T K S P L F MG K V V N P T Q K 注 ： 表 中下划线标 出的甲硫氨酸残基发生氧化修饰 。 No t e：Me t h i o n i n e r e s i d u e u n d e r l i n e d i n t h e t a b l e w e r e o x i d i z e d 3 3尿液多肽组的阶梯序列特征 在鉴定到的尿液的多肽中， 存在一系列相互之间无论是 N端还是 C端只相差一个或几个氨基酸的 阶梯状肽段 ( 表 4 和表5 ) 。在血清血浆多肽组中均出现这样阶梯多肽的规律， 并且这些阶梯多肽在 整个血清或血浆多肽组中占主要地位 ， 能够体现体 内特定的蛋 白水解作用m 。本研究表 明， 该现象在 尿 液多肽组 中同样存 在 。 V i l l a n u e v a 等 认为 ， 来源于纤维蛋 白肽A的9 个 阶梯 多肽可能成为癌症 的 表4 具有阶梯肽段的蛋白质 T a b l e 4 P r o t e i n s w i t h l a d d e r p e p t i d e s 蛋 白序列 Ac e s s i o n 蛋 白质 P r o t e i n 序列 e q u e n c e 翻译后修饰 M P 6l 7 6 9 E9 P EA4 LL KNGEm EKVEHS DL S F S K L LKNGERI EKVEHS DI SF S KDW 口黜 褊in T|IK N G E R IE K V E H s D L S F s K D w s L L KNGERI EKVEHS DL S F S KDW S F 曼 譬 登 旦 S V I DQ S R V L N L S V I DQ S R V L N L G s V I DQ s R V L N L G P 1 分泌型尿调蛋 白 S V I DQ S R V L N L G P I T 。 “ ， S V I D Q S R V L N L G P I T Rs e c r e t e d t o r m S V I DQ S R V L N L GP I T R K S V I D Q S R V L N L G P I T R 第 1 0 位天冬酰胺发生脱氨化 D e a m i d a t e d ( N ) 1 0 S V I DQ S R VL N L G P IT RK 第 1 0位 天冬酰胺发生脱氨化 D e a mi d a te d ( N) 1 0 _- F L N G NK L A R V A AG A F Q G L 富亮氨酸 糖蛋 白 P 0 2 7 5 0 L e u c i n e ric h c t - 2 一 g l y c o p r o t e i n F L N G N KL A R V A AG AF Q G L R Q F L N G N KL A R V A A G AF Q G L R Q L D F L N G N K L A R V A A G A F Q G L R QL D M F L N G N KL AR V A A G AF Q G L RQ L D ML 7 2 0 分 析 化 学 第 4 4卷 特征性多肽。在尿液总共鉴定到的 1 2 3种蛋白中， 鉴定到至少 2条 以上阶梯多肽 的蛋 白有 6 1个 ， C端 相差一个或几个氨基酸的阶梯肽段如表 4所示。在 巨球蛋 白( 卢 一 2 一 mi c r o g l o b u l i n ) 鉴定到的一系列肽 段中， L L K N G E R I E K V E HS D L S F S K 的 C端依 次增加 5个氨基酸 D，w，s ，F ，K， 最长 的为 L L K N G E R I E K v E H s D L s F S K D wS F Y； 在 分 泌 型 尿 调 蛋 白 ( U r o mo d u l i n ， s e c r e t e d f o r m) 、 富 亮 氨 酸 2糖 蛋 白 ( L e u c i n e r i c h a - 2 一 g l y c o p r o t e i n ) 鉴定到的肽段中也是如此 。肽段 N端出现氨基酸依次递增 ， 例如表 5中 列出 的血 清 丝 氨酸 蛋 白酶抑 制 因 子 ( P l a s m a s e ri i l e p r o t e a s e i n h i b i t o r ) 、 朊 蛋 白 ( M a j o r p r i o n p r o t e i n ( F r a g m e n t ) ) 、 钠钾转运 A T P酶( S o d i u m p o t a s s i u m t r a n s p o r t i n g A T P a s e ) 等。 表 5 C端依次递增 的阶梯肽段 T a b l e 5 L a d d e r p e p t i d e s wi t h a d d e d a mi n o a c i d s a t C t e r mi n a l 蛋 白序列 蛋 白质 序列 翻译后修饰 Ac e s s i o n P r o t e i n S e q u e n c e P TM I VDNNI LF L GKVNRP F I VDNNI L F L GKVNRP S QR L V F NR P F L MF I VD N N I L F L G K V N R P N S Q R L V F NR P F L MF I V D N N I L F L G K V N R P P o h 血 浆 萄 馨 季 酶 L N S Q R w R P F L M F IV D N N I L G K V N R P 4 钾 O xid硫 氨a tion 酸 发( M )告 氧 化 修 饰 t t a s ma s e Y l n e p r o t e a s e i n h i b i t o r L N S Q R L VF N R P F L MF I V D N NI L F L G K V NR P R L N S Q R L VF N R P F L MF I V D N NI L F L G K V NR P AR L N S Q R L V F N R P F L MF I V D NN I L F L G KV N R P S AR L N S Q R L V F N R P F L MF I V D N NI L F L G K V NR P 朊蛋 白片段 旦 曼 曼 曼 N R P F L M F I V D N N I L F L G K V N R P 一 一 VGGL GGYML GS AMS RP I I HFGS DYEDR VVGGL GGYML GS AMS RPI I HF GS DYEDR A 2 A 2 Vl Ma j o r p r i o n p r o t e i n A V V G G L G G Y ML G S AMS R P I I HF G S D Y E D R L r a g me n t J GAVVGGLGGYMLGS AMS RP I I HF GS DYEDR GAAAAGAVVGGL GGYML GS AMS RPI I HF GS DYEDR DGGGS P KGDVDP FYYDYET VRNGGU 钠钾转运 A T P酶 MD G G G s P KG D v D P F Y Y D Y E T v RN G G L I P 5 4 71 0 S o d i u m p o t a s s i u m t r a n s p o n g ATP a s e S MDGGGS P KGDVDP FYYDYET VRNGGL I L S MDGGGS P KGDVDPF YYDYETVRNGGLI 3 4 尿液多肽组的生物信息学分析 目前， 多肽组研究较多根据不同分子量的质谱峰的比较， 本研究利用纳升液相色谱 高分辨串联质 谱分析尿液多肽组学， 不仅鉴定了肽段序列信息， 并且从这些肽段归属的蛋白质水平分析了这些蛋白质 之间的相关性 ， 为后续的蛋白质降解机制研究提供了新的依据 。将得到的 1 2 3种蛋 白在 S t ri n g ( h t t p ： s t r i n g d b o r #) 数据库中进行检索 ， 共 检索到 9 9种蛋 白质 ， 其 中 6 8种蛋 白之 间存 在相互作用关 系 ， 如图 2所示 ， 在肽段水平上没有看到的潜在联系能够在蛋 白质水平上予 以分析 。在 P A N T H E R数据 库 ( h t t p ： w w w p a n t h e r d b o r #) 中对这些蛋白进行 聚类分析后发现 ， 在尿液 中鉴定到的这些多肽主要 参与生物调节 ( 1 0 8 ) 、 代 谢过 程 ( 2 1 )以及 细胞进 程 ( 1 5 6 ) 等 ( 图 3 A) ， 主要 承担催 化 功能 ( 3 5 4 ) 、 结合功能( 1 8 8 ) 以及受体功能 ( 1 5 6 ) 等 ( 图 3 B) ， 主要分布在胞外区( 4 7 1 ) 和细胞 内( 1 7 6 ) ( 图 3 c) 。 4 结 论 本研究采用纳升液相色谱 高分辨飞行时间质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰， 建立了一种快速 灵敏的尿液多肽组学分析方法。研究结果表明， 尿液多肽组具有较宽范围的分子量和等电点分布， 尿液 多肽组在蛋白质水平上分布具有不均一性， 说明纳升液相色谱一 高分辨串联质谱可以更全面细致地给出 尿液多肽组信息， 为相关医学和生物学研究提供了方法学支持。 7 2 2 分 析 化 学 第4 4卷 Re f c ! r e nc e s 1 A n d e r s o n N L， Ma t h e s o n A D， S t e i n e r S C u r r O p i n B i o t e c h ， 2 0 0 0 ，1 1 ( 4 ) ： 4 0 8 4 1 2 2 B a g g e r m a n G， V e r l e y e n P ， C l y n e n E， H u y b r e c h t s J ， D e L o o f A， S c h o o L C h r o m a t o g B， 2 0 0 4， 8 0 3 ( 1 ) ： 3 1 6 3 S c h r a d e r M ，S c h u l z Kn a p p e P T r e n d s Bi o t e c h n o 1 ， 2 0 0 1，1 9：5 5 6 0 4 Xi a n g Y，Ku r o k a wa M S，Ka n k e M ，T a k a k u wa Y，Ka t o TMe t h o d Z Bi o 1 ， 2 0 1 0， 6 1 5：2 5 9 2 7 1 5 S c h u h e I ， T a m m e n H， S e l l e H， S c h u l z K n a p p e P E x p e r t R e v Z Di a g n ， 2 0 0 5 ， 5 ( 2 ) ： 1 4 5 1 5 7 6 X I E We i ， WA N G J u a n ， Y U We i ， Y A N G L i ， L I U X i a o L i J o u r n a l o fH y g i e n e R e s e a r c h ， 2 0 1 3， 6 ：1 0 3 1 1 0 3 5 谢 尉 ， 王 娟 ， 于 薇 ， 杨 笠 ， 刘小力 卫生研 究， 2 0 1 3 ， 6 ： 1 0 3 1 1 0 3 5 7 De k k e r L J，B o o g e r d W ， S t o c k h a mme r G，Da l e b o u t J C，S i c c a ma I ，Z h e n g P P，B o n f r e r J M， Ve r s c h u u r e n J J ，J e n s t e r G， V e r b e e k M M， L u i d e r T M， S m i t t P A S Mo 1 C e f f P r 0 t e o mi c s ， 2 0 0 5 ， 4 ( 9 ) ：1 3 4 1 1 3 4 9 8 V e r h a e r t P ， U t t e n w e i l e r - J o s e p h S ， d e V r i e s M，L o b o d a A，E n s W，S t a n d i n g K G P r o t e o mi c s ， 2 0 0 1 ， l ( 1 ) ： 1 1 8 - 1 3 1 9 Ba k u n M，K a r c z ma r s k i J ，P o z n a n s k i J ，R u b e l T，Ro z g a M，Ma l i n o w s k a A，S a n d s D，He n n i g E，O l e d z k i J ，O s t r o w s k i J ， D a d l e z MP r o t e o m i c s C l i n A p p 1 ， 2 0 0 9， 3 ( 8 ) ： 9 3 2 - 9 4 6 1 0 Bo c c a r d o F，Ru b a g o t t i A，N u z z o P V，A r g e l l a t i F，S a v a r i n o G，R o ma n o P，Da mo n t e G，R o c c o MP r o f u mo A，I n t C a n c e r ， 2 0 1 5 ， 1 3 7 ( 1 0 ) ： 2 3 9 4 2 4 0 2 1 1 Z l o t t a A REu r o U r o 1 ，2 0 0 6，4 9( 4)： 7 5 6 7 5 7 1 2 Gr a t e r o l F，Na v a r r o Mu n o z M，I b e r n o n M，L o p e z D， T r o y a M I ，P e r e z V， B o n e t J ，Ro me r o RB MC Ne p h r o 1 ，2 0 1 3，1 4： 8 2 1 3 C h e n g G， Wa n g z G， L i u Y L ， Z h a n g J L ， S u n D H，N i J Z C h e mC o mm u n ， 2 0 1 2 ， 4 8 ( 8 2 ) ： 1 0 2 4 0 1 0 2 4 2 1 4 Mi o t t o M C ，R o d r i g u e z E E，V a l i e n t e G a b i o u d A A，T o e s M o n s e r r a t V，B i n o l fi A，Q u i n t a n a r L ，Z w e c k s t e t t e r M， G r i e s i n g e r C， F e r n a n d e z C 0 I n o r g C h e m ， 2 0 1 4 ， 5 3 ( 9 ) ： 4 3 5 0 - 4 3 5 8 1 5 V i l l a n u e v a J ， S h a f f e r D R， P h i l i p J ， C h a p a r r o C A， E r d j u m e n t B r o m a g e H， O l s h e n A B， F l e i s h e r M， L i l j a H， B r o g i E， B o y d J ， S a n c h e z C a r b a y o M， H o l l and E C， C o r d o n C a r d o C ，S c h e r H I ， T e m p s t P C l i n I n v e s t ， 2 O O 6， 1 1 6 ( 1 ) ： 2 7 1 2 8 4 1 6 K o o m e n J M， L i D H，X i a o L C， L i u T C， C o o m b e s K R， A b b r u z z e s e J ， K o b a y a s h i R P r o t e o m e R e s ， 2 0 0 5， 4 ( 3 ) ： 9 72-98 】 Ana l y s i s o f Ur i ne Pe pt i d o mi c a nd Po s t - t r a n s l a t i o n M o di fic a t i o ns b y Na n o Li qu i d Chr o ma t o g r a ph y- Hi g h Re s o l u t i o n Ta n de m M a s s S pe c t r o me t r y HONG Xi a o Yu ，L I S h u i Mi n g ，W ANG Yo n g ( C o l l e g e of L if e a n d O c e a n S c i e n c e ， S h e n z h e n K e y L a b o r a t o r y of Mi c r o b i a l G e n e t i c E n g i n e e r i n g ， S h e n z h e n Key Lab o r a t o r y of M a r i n e B i o r e s o u r c e s a n d E c o l o g f， S h e n z h e n U n i v e r s i t y ， S h e n z h e n 5 1 8 0 6 0 ， C h i n a ) Ab s t r a c t Pe pt i d o mi c s i s a n e me r g i n g fie l d b r a n c h i n g f r o m p r o t e o mi n c s t h a t t a r g e t s e n d o g e n o u s pe p t i d e s o f a who l e o r g a n i s m o r a s u b s y s t e mMa n y p e p t i d e s i n b o d y flu i d s i n c l u d i n g u rin e a r e b i o ma r k e r s wi t h h i g he r c l i n i c a l s e n