TGFBI蛋白与多倍体肿瘤及肿瘤耐药的相关性研究-妇产硕士论文

分类号：R 7 1 密级： 学位类别： 科学学位团专业学位口 学校代码：10062 学号：2 0 1 1 6 0 2 2 7 1 学科门类：医学 又坪酱科鼻母 羽I I I I I 赣啊蠢O I 眦U N I V 募I l S l l V 硕士学位论文 M A S T E R SD I S S E R T A T I O N 论文题目：T G F B I 蛋白与多倍体肿瘤及肿瘤耐 药的相关性研究 TIT L E S t u d yo nt h ec o r r e l a t i o nw i t hT G F B I p r o t e i n ，p o l y p l o i d yt u m o r a n dc h e m o r e s i s t a n c e 一级学科：临床医学 二级学科：妇产科学 论文作者：李晶晶 指导教师：王德华 导师组成员：刘国艳 天津医科大学研究生院 二。一四年五月 万方数据 学位论文原创性声明 【I I I I I I II I I II l lI l l lI I II I IU I Y 2 6 9 8 6 8 9 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：乏龇日期： 纠| 年明垆 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密囹。 ( 请在相对应的方框内打“、”) 学位论文作者签名：盘丕日期：一年碉巧日 引币签孙输醐：晰年F 月矽日 o 一 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 当今恶性肿瘤发展迅速，已成为人类健康的严重威胁。恶性肿瘤的治疗主 要包括手术治疗、化疗及放疗，大概有近6 0 的病人接受化疗。紫杉醇作为卵 巢癌化疗的一线药物，其有效率可达7 0 8 0 ，但是卵巢癌的5 年生存率仍徘 徊在3 0 4 0 ，主要原因是治疗过程中肿瘤出现耐药，导致化疗失败。据统计， 9 0 以上肿瘤患者的死亡在不同程度上是受肿瘤耐药的影响。 转化生长因子诱导的基因( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - f ；i n d u c e dg e n e ， T G F B I ) 蛋白属于细胞外基质分子之一，最初被关注的是其调节细胞粘附和迁移 的能力。在不同的肿瘤中，T G F B I 蛋白的表达也不相同，如在结肠癌、食管癌、 肾癌其表达升高，而在非小细胞肺癌、乳腺癌中表达将低。有研究显示，T G F B I 基因的甲基化与紫杉醇耐药有关。T G F B I 表达的缺失可增加非小细胞肺癌对凋 亡的抗性，且增加T G F B I 的表达可以提高其对多种化疗药物的敏感性。说明 T G F B I 蛋白与肿瘤耐药性有关。 许多研究提示多倍体细胞可以引起肿瘤耐药。我们的前期研究在纺锤丝毒 性药物的诱导下可形成稳定生长的多倍体肿瘤细胞M D A M B 2 3 1 T ，且该细胞 除了对V P l 6 更敏感外，对紫杉醇类、表阿霉素、奥沙利销、长春新碱及氟尿嘧 啶等多种化疗药物都表现为耐药，且与原肿瘤细胞相比具有显著性差异。这种 多倍体细胞与原代细胞相比，低表达T G F B I 蛋白。而将T G F B I 基因转染 M D A M B 2 3 1 T ，发现可以增加其对紫杉醇的敏感性。那么多倍体肿瘤细胞的 发生、肿瘤细胞的耐药与T G F B I 蛋白的表达三者之间是否有密切联系呢? 现国 内外未见报道。 本实验以乳腺癌M D A M B 2 3 1 细胞为研究对象，利用细胞转染技术使其瞬 时过表达T G F B I 蛋白，运用M T T 法检测两组细胞的细胞生长抑制率，运用流 式细胞仪比较两组细胞的细胞周期、细胞凋亡以及细胞的倍体变化，初步探讨 T G F B I 蛋白与多倍体肿瘤及肿瘤耐药之间的关系。 方法： 1 将载有T G F B I 基因的质粒及空质粒分别瞬时转染M D A M B 2 3 1 细胞， 并分为实验组与对照组。 I 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 2 利用w e s t e r nb l o t 技术检测两组细胞中T G F B I 蛋白的表达，验证转染效 果。 3 M T T 法比较两组细胞的细胞生长抑制率。 4 利用流式细胞仪通过P I 染色比较两组细胞的细胞周期及细胞染色体倍 体变化。 5 利用流式细胞仪通过A n n e x i nV - F I T C P I 法比较两组细胞的细胞凋亡情 况。 结果： 1 w e s t e r nb l o t 检测结果显示：T G F B I 蛋白在实验组高表达，说明T G F B I 基 因已成功转染M D A M B 2 31 细胞。 2 M T T 实验结果显示：以不同浓度的紫杉醇处理过表达T G F B I 蛋白的 M D A M B 2 3 1 细胞及转染空质粒的对照组细胞7 2 小时后，相对于转染空质粒的 对照组细胞，过表达T G F B I 的细胞表现出更高的生长抑制率。 3 细胞周期实验结果显示：紫杉醇处理过表达T G F B I 蛋白的 M D A M B 2 3 1 细胞较转染空质粒的对照组细胞表现出更高的G 2 M 阻滞，且对 照组中多倍体细胞的生成率明显较实验组高。 4 细胞凋亡实验结果显示：对照组细胞的凋亡率明显高于实验组。 结论： 1 T G F B I 蛋白是抑制紫杉醇诱导多倍体细胞产生的因素之一。 2 上调T G F B I 蛋白可以增加肿瘤细胞对纺锤丝毒性药物的敏感性。 3 T G F B I 蛋白是缓解肿瘤耐药的因素之一。 4 在肿瘤组织中，多倍体细胞的产生是引起肿瘤耐药的原因之一。 关键词：多倍体肿瘤耐药转化生长因子诱导的基因( T G F B I ) 紫杉醇 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 A b s t r a c t O b je c t iM e ： N o w a d a y s ，t h em a l i g n a n tt u m o ri sd e v e l o p i n gr a p i d l ya n db e c o m i n gas e r i o u s t h r e a t e nt oh u m a nh e a l t h T h et h e r a p i e so fm a l i g n a n tt u m o ri sp r i m a r i l yi n c l u d i n g o p e r a t i v et r e a t m e n t ， c h e m o t h e r a p ya n dr a d i o t h e r a p y A b o u t6 0 o fp a t i e n t sa r e t r e a t e db yc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g s P a c l i t a x e li su s e da st h ef i r s t - l i n ed r u g st ot h e o v a r i a nc a n c e r ，w h i c he f f i c i e n c yC a nb ea b o u t7 0 - 8 0 H o w e v e r , t h e5 - y e a r s u r v i v a lo fo v a r i a nc a n c e rr e m a i n s3 0 4 0 T h ec h e m o r e s i s t a n c ei so n eo ft h e m a i nr e a s o nf o rt r e a t m e n tf a i l u r e A c c o r d i n gt os t a t i s t i c s ，m o r et h a n9 0 o fp a t i e n t s w i t hc a n c e rd e a t ha t t r i b u t e dt ot h ec h e m o r e s i s t a n c ei nd i f f e r e n td e g r e e T G F B I ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 i n d u c e dg e n e ) i so n eo fe x t r a c e l l u l a r m a t r i xw h i c hh a sb e e ni d e n t i f i e dt or e g u l a t em i g r a t i o na n dc e l l u l a ra d h e s i o n T h e e x p r e s s i o nl e v e lo fT G F B Ip r o t e i ni s d i f f e r e n ti nt h et u m o r s F o re x a m p l e ，i ti s u p r e g u l a t e d i n c o l o r e c t a lc a n c e r ， e s 叩h a g u sC a n C e ra n dr e n a lC a n C e r w h i l ei s d o w n r e g u l a t e di nn o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e ra n db r e a s t c a n c e r As t u d ys u g g e s t e d t h a tT G F B Ih y p e r m e t h y l a t i o np l a y sar o l ei np a c l i t a x e lc h e m o - r e s i s t a n c e T G F B I p r o t e i nC a np r o m o t et h er e s i s t a n c eo fn o n s m a l lc e l ll u n gC a n C e rt oa p o p t o s i sw h e n i t i su n d e t e c t a b l ep h e n o t y p e s ，w h i l eu p r e g u l a t i n go fT G F B Ip r o t e i nC a ne n h a n c et h e s e n s i t i v i t y t os o m ek i n d o fc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g s S oT G F B Ip r o t e i nh a sa r e l a t i o n s h i pw i t hc h e m o - r e s i s t a n c e S t u d i e ss u g g e s tt h a tp o l y p l o i d i z a t i o nc a nl e a dt oc h e m o r e s i s t a n c e O u re a r l y s t u d ys h o wt h a tt r e a t i n gt h eb r e a s tC a n C e rc e l lw i t hs p i n d l ep o i s o nC a ng e tp o l y p l o i d y c e l l ( M D A M B 一2 31 T ) w h i c hC a nb eg r o wc o n t i n u o u s l y T h ep o l y p l o i d yc e l li sm o r e r e s i s t a n tt os o m eo fc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g ss u c ha sp a c l i t a x e l ，d o c e t a x e l ，v i n c r i s t i n e ， o x a l i p l a t i n ，5 - F U a n d e p i r u b i c i ne x c e p t f o rV P16t h a n p r i m a r y c e l l T h e M D A M B 2 31 TC a nb em o r es e n s i t i v i t yt op a c l i t a x e lw h e ni st r a n s f e c t e dT G F B I H o w e v e ri st h e r ear e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep o l y p l o i d i z a t i o n ，c h e m o 。r e s i s t a n c ea n d T G F B Ip r o t e i n T h ea n s w e ri su n k o w n W eu s e dt h eM D A M B 2 31a st h eo b j e c t U p r e g u l a t i n gT G F B Ip r o t e i nb y I I I 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 t r a n s f e c t i n gt h ec e l l ，c o m p a r i n gt h eg r o w t hi n h i b i t i o nr a t eb yM T Te x p e r i m e n ta n d d e t e c t i n gt h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o n ，a p o p t o s i sa n dD N Ap l o i d ya n a l y s i sb yf l o w c y t o m e t r yt oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np o l y p l o i d i z a t i o n ，c h e m o - r e s i s t a n c ea n d T G F B Ip r o t e i ni nt h i ss t u d y M e t h o d s ： 1 T r a n s f e c t i n gT G F B I - c o n t a i n i n gp l a s m i da n db l a n kg e n et oM D A M B 一2 3 1 c e l lt of o r mt w og r o u p s 2 D e t e c t i n gt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yb yW e s t e r nB l o te x p e r i m e n t 3 D e t e c t i n gt h ed i f f e r e n c e so fg r o w t hi n h i b i t i o nr a t eb yM T Te x p e r i m e n t 4 A n a l y z i n gt h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o na n dD N Ap l o i d ya n a l y s i sb yf l o w c y t o m e t r yt h r o u g h d y e i n gt h ec e l lw i t hP I 5 A n a l y z i n gt h ea p o p t o s i sb yu s i n gA n n e x i nV - F I T C P Ii n s t r u m e n t R e s t Jlt S 1 T G F B Ip r o t e i nl e v e li sh i g h e ri nt h ec e l l so v e r - e x p r e s s e dT G F B Ip r o t e i n w h i c hs u g g e s tU St h et r a n s f e c t i o ni sf i n i s h e d 2 T h eM T Te x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wU St h a tt h eg r o w t hi n h i b i t i o nr a t ei s h i g h e ri nT G F B Io v e r - e x p r e s s i o nc e l l st h a nt h ec o n t r o lc e l l sa f t e rt r e a t i n gt h ec e l l s w i t hp a c l i t a x e li nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nf o r4 8h o u r s 3 T h es t a g n a t i o nl e v e lo fG 2 Mp e r i o di nc e l lc y c l ei sh i g h e ra n dt h e g e n e r a t i o no fp o l y p l o i d yi sl o w e ri nT G F B Io v e r - e x p r e s s i o nc e l l s 4 T h er a t eo fa p o p t o s i si sh i g h e ri ni nT G F B Io v e r - e x p r e s s i o nc e l l s C o n eIU Sio n s ： U p - r e g u l a t i n go f T G F B Ip r o t e i nC a ne n h a n c et h es e n s i t i v i t yt op a c l i t a x e l T G F B Ip r o t e i nC a nc o m p e t ec h e m o r e s i s t a n c e T G F B Ip r o t e nC a nr e s t a i nt h ep o l y p l o i d i z a t i o nl e a d i n gb ys p i n d l ep o i s o n P o l y p l o i d i z a t i o nC a nl e a dt oc h e m o - r e s i s t a n c e K e y w o rd s ：p o l y p l o i d y , c h e m o r e s i s t a n c e ，T G F B I ，p a c l i t a x e l I V 1 2 3 4 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要I A b s t r a c t I I I 缩略语符号说明 前言1日U 舌1 研究现状、成果1 研究目的、方法4 T G F B I 蛋白与多倍体肿瘤及肿瘤耐药的相关性研究5 对象和方法5 结果1 6 讨论21 结j 淦2 7 展望2 8 参考文献2 9 发表论文和参加科研情况说明3 5 综述3 6 T G F B I 蛋白与肿瘤关系的研究近况3 6 综述参考文献4 3 致谢4 9 V 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 缩略语 D M S O E C M F B S H R P k D O D P B S P M S F r p m S D S S D S P A G E T r i S T G F B I T G F - p P I 1 3 - a c t i n R P M l l6 4 0 缩略语符号说明 英文全称 d i m e t h y ls u l p h o x i d e e x t r a c e U u l a rm a t r i x f e t a lb o v i n es e r u m h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e k i l o d a l o t n o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e r o t a t ep e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e S D S P o l y a c r y l a m i dg e ll e t r o p h o r e s e s 3 - b y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3i n d u c e d g e n e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 P r o p i d i u mI o d i d e B e t a - a c t i n R o o s e v e l tP a r kM e m o r i a lI n s t i t u t e M e d i u m P o l y e t h y l e n eg l y c o ls o r b i t a n m o n o l a u r a t e V I 中文全称 二甲基亚枫 细胞外基质 胎牛血清 辣根过氧化物酶 千道尔顿 光密度值 磷酸盐缓冲液 苯甲基磺酰氟 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 S D S 聚丙烯酞胺凝胶 电泳 三羟甲基氨基甲烷 转化生长因子诱导的 基因 转化生长因子p 碘化丙啶 内参照基因( p 肌动蛋 白) R P M l l6 4 0 培养基 聚氧乙烯山梨醇酐单 月桂酸酯 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 刖舌 研究现状、成果 我国是一个发展中大国，普遍存在着工业化发展、人口老龄化、生活习惯 不合理、环境污染与生活方式不健康的不良因素，恶性肿瘤逐渐变成国民生命 与健康的严重威胁。据( 2 0 1 2 中国肿瘤登记年报最新报道，我国每年新发肿 瘤病例约为3 1 2 万例，也就相当于每分钟就有6 人被诊断为恶性肿瘤，而每年 死于恶性肿瘤的病例可达2 7 0 万例；世界卫生组织也有相关报告，2 0 0 8 年全世 界新增恶性肿瘤患者约有1 2 7 0 万，约有7 6 0 万患者死于恶性肿瘤，尤其在发展 中国家，恶性肿瘤新增例数逐年增加，据估计到2 0 3 0 年可能会增至1 3 2 0 万。 同时，随着恶性肿瘤的发展，对恶性肿瘤的诊治水平也逐步提高。现如今恶性 肿瘤的治疗手段多种多样，主要包括手术治疗、放疗、传统化疗、靶向治疗、 内分泌治疗以及基因治疗等，其中手术、放疗、化疗这些传统治疗手段仍然是 当前肿瘤治疗的主流。据统计，有4 0 的肿瘤患者接受手术及放疗，近6 0 的 患者使用化疗。 随着现代医学的进步，全球抗肿瘤药物的研发也发展迅速，总结起来包括： 细胞毒性药物、内分泌治疗药物、免疫治疗药物、基因治疗药物、靶向抗肿瘤 药物【l 】。其中，紫杉醇即属于细胞毒性药物中的微管稳定药。紫杉醇( p a c l i t a x e l ) 是一种从红豆杉属植物中提取出来的抗癌药物，W a i n 等于1 9 7 1 年提纯了紫杉醇， 并检测出其为复杂的二萜类化合物，具有抗肿瘤作用，其作用机制主要在于通 过促进微管形成并阻止其解聚，使微管的生理功能和结构受到破坏，影响细胞 骨架的构成，这样，细胞即会阻滞于G 2 M 期，有丝分裂不能完成，则肿瘤细胞 将会死亡，同时，紫杉醇除了以上功能，还伴有诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤 血管形成的功效【2 】。紫杉醇最初是用于卵巢癌及转移性乳腺癌的治疗，而现在发 展为许多恶性肿瘤的化疗一线药，是目前全球销售量最大的化疗药物【3 】。卵巢癌 是妇科肿瘤中预后最差的恶性肿瘤，紫杉醇作为卵巢癌的一线化疗方案，其有 效率可以达到7 0 8 0 ，但是患者的5 年生存率仍在3 0 4 0 ，其中2 年复发 率可达8 0 ，且复发后极易出现耐药，致使治疗更加困难甚至失败【4 】。卵巢癌的 复发与肿瘤耐药是导致卵巢癌治疗效果不能提升的重要原因。肿瘤耐药在其它 肿瘤的化疗过程中也频繁发生，所以肿瘤耐药是所有肿瘤治疗面临失败的重大 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 原因之一，同时也影响着肿瘤的复发与转移。据美国癌症协会分析每年恶性肿 瘤死亡病例后得出，其中发生肿瘤内在性耐药占6 1 ，获得性耐药占3 3 ，总 体来说，9 0 以上的肿瘤患者是因不同程度上的肿瘤耐药而导致死亡，故越来越 多的研究也就转移到了有关肿瘤耐药机制及肿瘤耐药逆转上来。 1 9 1 4 年B o v e r i 提出恶性肿瘤细胞存在遗传不稳定性( g e n e t i ci n s t a b i l i t y ) 的 学说，其包括微卫星不稳定性( m i e r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y , M I N ) 和染色体不稳定性 ( c h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y , C I N ) 5 - 6 ，其中多倍体的形成即为染色体不稳定性的一 种。现有关遗传不稳定性致使肿瘤形成有两种假说，一是突变假说，认为一些 合适基因突变的组合致使正常细胞转化成癌细胞，C I N 是细胞癌变后形成的；另 一种是C I N 假说，认为染色体不稳定是癌变的原因，而不是癌变的结果，而越 来越多的研究倾向于后者【刀。在肿瘤发生中经常出现细胞染色体的变化，其中肿 瘤D N A 含量变化，即出现异倍体( 包括多倍体) ，通常被认为是肿瘤恶性程度 较高的标志，同时也被认为是肿瘤治疗困难的标志，特别是提示肿瘤细胞的耐 药性【8 9 】。人体正常的细胞也存在多倍体现象，如胎盘滋养层巨细胞、巨核细胞、 骨骼肌细胞、正常的泌乳期乳腺细胞、膀胱上皮细胞、间皮细胞和神经细胞等 【l o 1 2 】。就细胞自身生存而言，倍增的染色体可以作为染色体丢失、基因丢失、突 变和失活的缓冲区，从而保持自身基因组的“稳定性”，而肿瘤细胞的遗传不稳定 性是发生耐药突变的重要原因【1 3 】。根据当今研究，当紫杉醇将细胞阻滞于有丝 分裂期时，对于正常细胞来说，这些异常将导致细胞凋亡机制的激活；但是有 些细胞则可以直接忽略这些异常，逃离这种阻滞作用，在染色体没有完成有丝 分裂的情况下进入到下一个细胞周期，即形成了多倍体细胞【1 4 】，而多倍体细胞 又能促进肿瘤的发展和肿瘤耐药性的产生【1 5 】。 转化生长因子诱导的基因( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3i n d u c e dg e n e ， T G F B I ) 是由S k o m e rj 1 6 等筛选来源于经T G F B 1 处理和未处理的人肺腺癌细胞 系A 5 4 9 的e D N A 文库时发现的，又称B I G H 3 基因。T G F B I 基因位于人染色体 5 q 3 1 ，m R N A 全长2 6 9 1 K B ，含有1 7 个外显子，其大小约3 5 k b 【1 7 】，共编码6 8 3 个氨基酸。T G F B I 蛋白是一种细胞外基质，包含1 个N 末端信号肽，4 个高度 保守的同源内部重复结构域( f a s c i c l i n 1 ，F a s 一1 ) 和一个精氨酸甘氨酸天冬氨 酸( a r g i n i n e g l y c i n e a s p a r t i ca c i d ，R G D ) 基序，其最初被研究的功能是有关细 胞的粘附和迁徙i t 6 。S h a o 等【1 8 】发现在正常和永生化的细胞系中T G F B I 蛋白的表 达水平相对较高，而在肿瘤细胞系T G F B I 蛋白的表达水平明显下调。但是在对 ，) 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 T G F B I 的其它研究中又发现，在有些恶性肿瘤中，T G F B I 蛋白表达升高，在有 些则表达降低。如在结肠癌【1 9 】、食管癌【2 0 】、肾癌【2 l 】、脑胶质瘤【2 2 】等肿瘤组织中 检测出T G F B I 蛋白高表达，而在非小细胞肺癌【2 3 】、乳腺癌【2 4 1 、皮肤癌【2 5 1 等T G F B I 蛋白的表达则与肿瘤的发展程度呈负相关。有研究显示，T G F B I 蛋白表达的缺 失可增加非小细胞肺癌细胞对凋亡的抗性，从而促进细胞生长和肿瘤发生，而 增加T G F B I 蛋白的表达可以促进肺癌细胞对多种化疗药物的敏感性【2 3 】。A h m e d 等的研究也显示，T G F B I 蛋白可以稳定微管性能而使卵巢癌对紫杉醇的敏感性 升高 2 6 】。还有有关T G F B I 基因的甲基化与紫杉醇耐药关系的研究【2 7 】。这些都提 示T G F B I 蛋白不仅与恶性肿瘤的发生发展转移等有关，与恶性肿瘤的耐药也有 密不可分的关系。 我们的前期研究使用纺锤丝毒性药物诺考达唑处理乳腺癌M D A M B 2 31 细 胞，采用流式分选、鉴定获得多倍体细胞，经有限稀释法克隆筛选得到具有克 隆能力、能够长期稳定存活和传代的多倍体细胞M D A M B 2 3 1 T 细胞。经w e s t e r n b l o t 技术测得T G F B I 蛋白在M D A M B 2 3 1 T 细胞中较M D A M B 2 3 1 细胞低表 达，利用细胞转染技术，将载有T G F B I 基因的质粒转染至M D A M B 一2 3 1 一T 细胞 中，M 1 v r 实验结果显示提高T G F B I 蛋白的表达，可以提高肿瘤对纺锤丝毒性药 物( 紫杉醇和诺考达唑) 的敏感性。前期研究的结果可以说明纺锤丝毒性药物 可以诱导多倍体细胞的形成且多倍体细胞较原代细胞具有更高的耐药性，那么 多倍体肿瘤细胞的产生、肿瘤细胞的耐药性与T G F B I 蛋白的表达三者之间是否 有联系? T G F B I 蛋白是否可以抑制纺锤丝毒性药物诱导多倍体细胞的产生? 目 前尚无明确证明。但这有可能是有关肿瘤诊断治疗中新的切入点，有助于了解 肿瘤的发生与耐药的相关分子机制，更是肿瘤研究道路上的探索前进。本实验 将进一步研究多倍体细胞、肿瘤耐药与T G F B I 蛋白表达之间的联系。 3 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 研究目的、方法 实验流程图： 亘三固 8O 匝匦垂亟囹区叵垂亟困 80 通过分析细胞周期、细胞凋亡、细胞染色 体倍体变化，探讨T G F B I 引起肿瘤细胞的 生物学性状改变，通过M T T 方法检测 T G F B I 对肿瘤耐药性的影响。 4 万方数据 天津医科大学硕士学位论文对象和方法 T G F BI 蛋白与多倍体肿瘤及肿瘤耐药的相关性研究 1 对象和方法 1 1 实验材料 1 1 1 细胞来源及培养 1 人乳腺癌细胞M D A M B 一2 3 1 细胞由北京大学医学部肿瘤研究中心柯杨 教授惠赠。 2 M D A M B 2 3 1 细胞在含有1 0 新生小牛血清的1 6 4 0 培养基中培养，培 养环境：3 7 0 C ，5 C 0 2 细胞培养箱。 1 1 2 主要试剂 R P M l l6 40培养基HyClone公司 新生牛血清( F B S )G I B C O B R L 公司 E D T 胰酶 G I B C O B R L 公司 R N a s eAA m e r e s c o 公司 N o c o d a z o l e S i g m a 公司 紫杉醇碧云天生物技术研究所 M T T 碧云天生物技术研究所 R I P A 细胞裂解液碧云天生物技术研究所 S D S P A G E 蛋白上样缓冲液碧云天生物技术研究所 P M S F 碧云天生物技术研究所 1 3 - A c t i n 抗体( 鼠单抗) S i g m a 公司 T G F B I 抗体( 兔多克隆抗)A b c a m 公司 辣根酶标记山羊抗兔I g G 多克隆抗体 中衫金桥公司 辣根酶标记山羊抗小鼠I g G 多克隆抗体 中衫金桥公司 B i o t i n y l a t e dp r o t e i nl a d d e r C e l lS i g n a l i n gt e c h n o l o g y E C L 化学发光检测试剂盒 M i l l i p o r e 公司 B C A 试剂盒北京索来宝公司 质粒小提试剂盒( 去内毒素) 北京索来宝公司 D M S O 北京索来宝公司 A n n e x i nV - F I F C 细胞凋亡检测试剂盒 碧云天生物技术研究所 5 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 P I L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 1 1 3 主要仪器 A m e r e s e o 公司 L i f e t e c h n o l o g y 公司 C 0 2 恒温培养箱：美国( T h e r m oF o r m a 公司) O l y m p u sC K 4 0 倒置显微镜( O l y m p u s 公司) 低温离心机( 美国H e r a e u s 公司) 一次性培养皿，一次性培养板( 美国C o s t a r 公司) 微量移液器：( 美国T h e r m o 公司) M i n i P R O T E A N 3 垂直电泳系统( B i o R a d 公司) M i n iT r a n s B l o t 转移系统( B i o R a d 公司) 5 0 0 型酶标仪( 美国，B i o R a d 公司) 低温高速离心机( 日本) 台式离心机( 日本) 8 0 0 C 冰箱( 日本) 超净工作台( 美国) 流式细胞仪( 美国) 1 1 4 相关溶液的配制 1 P I 储液：l m g P I 溶于1 0 m l 三蒸水中混匀。将其分装到E P 管中，2 0 “ C 避光储藏备用。 2 紫杉醇储液：2 0 m g 紫杉醇溶于5 m l 无水乙醇，分装于E P 管，- 2 0 * ( 2 避 光储藏备用。 3 封闭液：5 脱脂奶粉、0 1 T w e e n 2 0 溶于T B S 溶液中。 4 M T T 储液：2 5 0 m g M T r 粉溶于5 0 m l 生理盐水，将M T T 完全混匀 后，用0 2 2 1 x r n 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装于E P 管，2 0 。C 避光储藏 备用。 5 P B S 缓冲液：N a C l8 9 ，K C l0 2 9 ，N a 2 H P 0 41 4 2 9 ，K H 2 P 0 40 , 2 7 9 ，三蒸 水8 0 0 m l ，充分搅拌溶解，用浓H C l 调P H 至7 4 ，最后用三蒸水定容至1 0 0 0 m l ， 分装，高压蒸汽灭菌2 0 分钟，4 “ C 保存备用。 6 T B S T 洗液：含0 1 T w e e n 2 0 的T B S 溶液。 7 1 0 R P M l l 6 4 0 培养基：1 6 4 0 培养基4 4 5 m l ，加5 0 m l 新生小牛血清，加 5 m l 的双抗试剂。 6 万方数据 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 8 1 0 过硫酸铵( A P S ) ：过硫酸铵0 1 9 ，加入去离子水l m l ，溶解混匀， 现用现配。 9 转膜缓冲液( T r a n s f e rb u f f s ) 成份配10 0 0 m l 体积所需各试剂的量 T d S 甘氨酸 l O S D S 甲醇 去离子 水 5 8 9 2 9 9 0 3 7 9 2 0 0 m l ( 待前三种溶解后再加甲醇) 以去离子水定容至1 0 0 0 m l 1 0 电泳缓冲液( E l e c t r o p h o r e t i cb u f f e r ，P H8 3 ) ：配置5 x S D S 电泳缓冲液 的储存液，使用时稀释为1x S D S 电泳缓冲液。 成份配10 0 0 m 1 5 x S D S 电泳缓冲液所需各试剂的量 T h S 甘氨酸 1 0 S D S 去离子水 1 5 1 9 9 4 9 5 0 m l 以去离子水定容至1 0 0 0 m l 1 1 细胞冻存液：按含1 0 d x 牛血清的R P M l l 6 4 0 培养基( 不含双抗试剂) ： D M S O 为9 ：1 的比例配制。 1 2 0 2 5 胰酶：胰酶0 2 5 9 ，E D T A 0 0 2 9 溶于l O O m lP B S 中，充分溶解， 以直径0 2 2 u m 微孔滤膜过滤除菌，分装后一2 0 保存备用。 1 3 P I 染液：含0 1 T r i t o n x 一1 0 0 ，l O O u g m lR N a s e A ，4 0 u g m lP I ，用P B S 定容，现配现用。 1 4 L B 培养液：将L B 肉汤粉2 0 9 融入1 0 0 0 m l 三蒸水中混匀，高压灭菌。 当液体温度降至常温时，加入氨苄青霉素，使其浓度调至l O O u g m l 。 1 2 实验方法 1 2 1 细胞培养 1 M D A M B 2 3 1 细胞常规培养于含1 双抗1 0 d x 牛血清的R P M I1 6 4 0 培 养基中，于3 7 、5 C 0 2 、饱和湿度的培养箱内培养，用终浓度0 2 5 的胰酶 消化传代。实验用细胞为每间隔4 8h 稳定连续传5 - 6 代后，处于对数生长期的 7 万方数据 天津医科大学硕士学位论文对象和方法 细胞。 2 灭菌及无菌操作：操作前应紫外灯照射灭菌台面3 0 m i n ，进入超净台前 7 5 酒精擦手和台面，所有操作应在酒精灯旁进行，所用器物须经火焰烧灼灭菌， 注意无菌原则。 3 细胞计数法：用9 0 酒精清洗计数板及盖玻片后，用镜头纸擦干，将盖 玻片覆盖在计数板上，用吸管充分吹打培养瓶中的细胞悬液，均匀后立即吸取 1 5 u l 悬液，从边缘虹吸入计数板与盖玻片之间的空隙，注意盖玻片下是否充满。 静止片刻于显微镜下观察并计数。计算四角大方格内细胞数( 如细胞位于大方 格的双线上，计数时则计上线不计下线，计左线不计右线) ，计算公式如下：细 胞数m l = ( 4 大格细胞总数4 ) x 1 0 4 稀释倍数。 4 细胞冻存：当细胞融合度达7 0 8 0 时，倒掉细胞培养液，用P B S 液 冲洗细胞两遍，加入0 2 5 的胰酶消化细胞，镜下观察至细胞变圆，间隙变大时， 去掉胰酶消化液，加入R P M I 1 6 4 0 + 1 0 F B S 培养液终止消化，吹打悬浮细胞， 1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，加入冻存液1 5 m l ( D M S O ：培养液= l ：9 ) ，移入 冻存管，逐层降温，保存于8 0 冰箱双层泡沫盒内或液氮中。 5 细胞复苏：细胞从液氮中取出后，迅速放入3 7 水浴锅中，并不时摇动， 水面高度不可接近或高于冻存管的盖沿，在l m i n 内使其完全融化，将细胞移入