硕士论文1、裂褶菌化学活性成分研究2、三七叶中非皂苷类成分研究

摘要 裂褶菌( S c h i z o p h y l l u m c o m m u n e F r . ) 隶属于真菌门 ( E u m y c o p h y t a ) ，担子菌纲 ( B a s id io m y c e te s ) ，伞菌目 ( A g a r ic a l e s ) ， 裂褶菌 科(S c h iz op h y lla c e a e ) 裂褶菌属 ( S c h i z o p h y l l u m ) a 2 0 0 3 年， 副研究员罗星野在云覃科技开发有限责任公司利用野生 的菌种实现了 裂褶菌的引种驯化人工培养子实体成功， 这在世界上尚属首次。 文 献检索有裂褶菌多 糖的结构、活性的大量报道，化学成分的报道很少。人工栽培 裂褶菌化学成分尚未见报道。 本论文采用现代分析技术， 对野生及人工培养裂褶菌的营养成分、 挥发性物质、 多糖及其它化学成分进行对比研究。 采 用溶剂提取、柱 层析等 化学手 段从 野生 及人工培养 裂褶菌中各分离得到 1 9 个化合物，用 I R , MS , N MR 、单晶衍射等技术检测，并与已知化合物文献数据 进行对比，鉴定了 8个化合物的结构。其中 7个化合物为首次从野生和人工培养 裂褶菌子实体中分别分离得到。 三 七 P a n a x n o to g in s e n g (B u r k ) F . H . C h e n 是 我国 的 传 统 珍 贵 药 材。 文 献 检 索， 三七叶中的非皂昔类化学成分的报道很少。本文在前人工作的基础上，采用硅胶 柱层析、 重结晶等方 法从三七叶中 提取分 离到巧个化合物， 鉴定了3 个 化合物。 关键词:裂褶菌三七人工培养挥发性成分多糖营养成分 化学成分 基 金 支 持: 国 家自 然 科学 基 金 ( 2 0 2 6 2 0 0 7 ) 云南省自 然科学 基金项目 ( 2 0 0 0 C 0 1 0 6 M ) Abs t r a c t S c h iz o p h y l l u m c o m m u n e F r . i s a k i n d o f e d i b l e f u n g u s w h i c h b e l o n g s t o S c h i z o p h y l l u m , S c h i z o p h y l l a c e a e , A g a r i c a l e s , B a s i d i o m y c e t e s , E u m y c o p h y t a . I n 2 0 0 3 , L u o X i n g y e , a n e x p e rt o f Y u n n a n E d i b l e R e s e a r c h I n s t i t u t i o n , d o me s t i c a t e d a n d c u l t i v a t e d S c h i z o p h y l l u m c o m m u n e s u c c e s s f u l l y f r o m w i l d o n e f o r t h e f i r s t t i me i n t h e w o r l d . B y s e a r c h i n g t h e d o c u m e n t s , w e f o u n d t h a t t h e r e a re m a n y r e p o rt s a b o u t t h e s t r u c t u r e s a n d t h e a c t i v i t i e s o f t h e w i l d S c h i z o t 功川 l u m c o m m u n e ; h o w e v e r , r e p o rt s a b o u t N i n e t e e n c o m p o u n d s w e r e i s o l a t e d r e s p e c t i v e l y f r o m t h e w i l d a n d c u l t u r e d S c h i z o p h y l l u m c o m m u n e b y m e a n s o f p r e p a r a t i v e t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d r e c r y s t a l l i z a t i o n , e t c . T h e s t r u c t u r e s o f 8 c o m p o u n d s w e r e i d e n t i f i e d b y m o d e rn t e c h n i q u e s ( I R , MS , N MR , e t c . ) a n d c o m p a r e d w it h t h e s t a n d a r d s p e c t r a a n d l i t e r a t u r e . S e v e n c o m p o u n d s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e c u l t u r e d S c h iz o p h y l l u m c o m m u n e a n d a n o t h e r s e v e n f r o m t h e w i l d S c h iz o p h y l l u m c o m m u n e f o r t h e f i r s t t i me P a n a x n o t o g i n s e n g ( B u r k ) F . H . C h e n i s t h e p r e c i o u s t r a d i t i o n a l m e d i c i n e i n C h i n a . B y s e a r c h i n g t h e d o c u me n t s , w e f o u n d t h a t t h e r e a r e f e w r e p o rt s a b o u t t h e c o n s t i t u e n t o f P a n a x n o t o g i n s e n g l e a v e s . I n t h e p r e s e n t t h e s i s , f i ft e e n c o m p o u n d s w e r e i s o la t e d f r o m P a n a x n o t o g i n s e n g l e a v e s b y m e a n s o f p r e p a r a t i v e t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d r e c r y s t a l l i z a t i o n , e t c . T h r e e o f t h e c o m p o u n d s w e r e i d e n t i f i d b y m o d e r n t e c h n i q u e s ( I R , M S , N MR , e t c . ) a n d c o m p a r e d w i t h t h e s t a n d a r d s p e c t r a a n d l i t e r a t u r e . K e y w o r d s : S c h i z o p h y l l u m p o l y s a c c h a r i d e com m un e尸a n a x n u t r i t i o n c o m p o n e n t s c h e mi c a l c u l t u r e c o n s t i t u e n t s ￥ 8 9 9 6 3 9 . d匕0口 尸明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽 我所知，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人 己 经发表或撰写 过的研究成果， 也不包含为获得云南大学或其 他教育机构的学位 或证明而使用过的 材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的 任何贡献均己 在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 研 究 生 签 名 属 主 2 童 we 期 2 0o !4 论文使用和授权说明 本人完全了 解云南 大学有关保留、使用学位论文的规定， 即: 学校有 权保留 并向国 家有关部门 或机构 送交学 位论文和论文电子版;允许论文被查阅或 借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文;授权学校将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索。 ( 保密的论文在解密后应遵循此规定) 二签 名 : 鼻 k t .、 。:簿 聪一 日 2 0 o - .I 0 3级硕十学位论文 第一部分 裂褶菌化学活性成分 研究 第一部份裂褶菌化学活性成分研究 第一章裂褶菌 的研究进展 裂褶菌( S c h iz o p h y l l u m c o m m u n e F r . ) 又称白 参、树花、八担柴， 隶属于真菌门 ( E u m y c o p h y l a ) ，担子菌纲( B a s i d i o m y c e l e s ) ，伞菌 目( A g a r i c a l e s ) ，裂褶菌科 (S c h iz o p h y l la c e a e ) ， 裂 褶 菌 属 (S c h iz o p h y l lu m 尹。 该 属已 经 发 现 的 共 有 3 个 种， 裂 褶 菌广布于世界各地。我国黑龙江、吉林、辽宁、山西、山东、江苏、内蒙古、安 徽、 浙汀、江西、 福建、台 湾、 河北、河南、 湖南、广东、 广西、海南、 一 甘 肃、 西藏、四川、贵州、海南等省均有分布。云南采食裂褶菌的历史悠久，因质嫩味 美，有特殊的浓郁香味，性平，具有滋补强壮、镇静作用，视其为高档食药用菌。 日 本及欧美等国对裂褶菌抗癌活性多糖成分和优良 菌株的选育等方面的研究 比 较活跃。裂褶菌多糖也成为抗肿瘤类药物进入市场，用于临床治 疗。国内的 研 究 重点集中于发酵条件和药用价值 - 5 . 2 0 0 3 年，云南省食用菌研究所副研究员罗 星 野在云荤科技开 发有限责任公司 利用野生的菌 种实现了裂褶菌的引种驯化并人 工 培养子实体成功，这在世界上尚属首次。 文献检索， 有野生裂褶菌多 糖的结 构、 活性的大量报道，其它化学成分的报道较少。 裂褶菌的生物学特性 1 . 1 . 1 生态习 性 裂褶菌广泛分布于世界各地，特别是 在热带、亚热带杂木林下常可找到它的 踪迹。 裂褶菌多生于夏、秋季初雨后栋、储、拷等阔叶 树的枯木树桩或倒木_ 上 ， 少数生 长在针叶树的枯木上，亦能在活树上生长，是段木栽培香菇、木耳等木腐 菌生产巾 的常见“ 杂菌” :川 。 裂褶菌属木 腐菌， 具有较强的分 解木质素、 纤维素的 能力。在含有萄葡糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素和木质素的基质上生长良 好。它同 时也需要钾、 镁、 钙、 磷等 矿质元素 们 。 裂褶菌属中 高温型菌 类， 菌丝生长 适温为7 3 0 0C ，最适温度为2 2 2 5 0 C ， 子 实体形成温度为1 4 2 0 0C,抱子萌发最适温度为2 1 -2 6 C。裂褶菌菌丝培养基最 适含水量为6 0 % -7 5 % 。菌丝生长阶段，适宜的空气相对湿度为7 0 % - 8 0 % ，子实体 形成阶段，空气相对湿度要求 在8 5 % - 9 5 % 之间。菌丝生长最适p H 5 - 6 ，子实体生 长最适p H 4 -5 “ . 0 3级硕十学位论文第一部分裂褶菌化学活性成分研究 1 . 1 . 2 酶系统 裂褶菌能 产生多 种酶。1 9 8 8 年， M a c K e n z i e C R “ 等报道， 裂褶菌可以 产生一 种 酷 酶， 催化 基质 中 纤 维 素 产 生阿 魏 酸 : 1 9 9 5 年， G o r d o n L P 等 研 究了 裂 褶菌 的 蛋白 质水解酶， 分析了其特性; 1 9 9 9 年， 方靖等Cs ， 研究了裂 褶菌的 纤维二糖脱氢酶 对纤维素的吸附条件， 探讨了 酶促动力学以及吸附模型; 同 年， 方靖等 7 又探讨了 其在木 质素降解中的作用和机制;2 0 0 0 年， 方靖等N 又通过细胞色素 C 还原法测定 了裂褶菌纤维二糖脱氢酶的酶活力。 1 . 1 . 3 交配类型 裂褶菌的有性生殖交配系统是典型的由两个交配因子控制的双因子四极性异 宗配合类型【9 。 这些因子在减数分裂时 独立分配、自由 组合， 所以 裂褶菌的担子经 减数分裂后形成的四个担饱子就具有不同的交配型，担抱子萌发形成具有不同交 酉 己 型的初级菌丝。 1 .2 裂褶菌的人工驯化和深层发酵 1 . 2 . 1 4 11 化 国内 关于裂褶菌栽培研究的报道较少，曾 素芳【 10 1 报道了 裂褶菌的培养方法; 李兆兰申 请了 裂褶菌的 培养工艺及其利用技术专利( 专利公开号: C N 8 5 1 0 3 4 9 2 A ) ; 罗星野等申请了人工培养裂褶菌子实体及其培养方法专利( 专利公开号: C N 土 3 0 6 0 8 4 A ) 。云南农业大学食用菌研究所现正进行云南野生裂褶菌资源的菌种筛选 和驯化研究。 1 . 2 . 2 母种培养 采用P D A 综合培养基( 马 铃薯2 0 鲍，葡萄搪2 0 g ， 磷酸二 氢钾0 . 5 g ， 蛋白 陈3 g , 磷酸氢二钾0 . 5 g , 硫酸镁0 . 5 g ,琼脂1 5 g ， 水1 0 0 0 m L , p H 自 然) 或者用葡萄糖2 0 g , 硫酸镁0 . 5 g ,磷酸二氢钾1 g ， 蛋白陈2 g , 酵母膏3 g ，琼脂1 6 g ，水1 0 0 0 m 1 , ( P H 4 . 6 ) 配制的培养基 . u 。 李荣春等通过在 C Y M ( 葡萄搪2 0 g ， 蛋白 陈2 g ,磷酸二氢钾。 . 5 g , 磷酸氢二钾0 . 4 8 g ，硫酸镁0 . 5 g ， 酵母浸膏4 g , 琼脂1 6 g ，水I O O O m L )培养基中加 入: 种不同浓度( 分别为O . O l m g / m L , 0 . 0 2 m g / m L , 0 . 0 3 m g / m L ) 的6 - B A , 2 , 4 - D , I B A , 丁 A 八 、 C C C , N A A 、云 大一 1 2 0 以 及G A 3 等8 种生长调节剂， 研究其 对裂褶菌菌丝生长 速 度的影响。结果发现，2 , 4 - D 在不同浓度下对菌丝生长均有促进作用，其中低浓 度( 0 . 0 1 m g / m L ) 的 促进效应最强:工 A A在高浓度( 0 . 0 3 m g / m L ) 下对菌丝生长有促进 作用;G A 3 , C C C 在浓度0 . 0 2 m g / m L 时对菌丝生长有明显促进作用;N A A 、云大一 1 2 0 在浓度0 . 0 3 m g / m L 时对菌丝生长有明显的 抑制作用，且云大一 1 2 0 的 抑制效 应最强; I B A , 6 - B A 在低浓度( 0 . O l m g / m L ) 和高浓度( 0 . 0 3 m g / m L ) 下均对菌丝有明显的抑制作 0 3 级硕十学位论文 第一部分 裂褶菌化学活性成分研究 用。 1 . 2 . 3 原种、栽培种培养” 2 1 以阔叶树类木屑为培养基质效果最好，棉籽壳、甘蔗渣、药渣也可作为培养 基质。 培养基常用配方有: 杂木屑8 8 % , 数皮1 0 % ， 石膏1 % ， 石灰1 % ， 含水量为6 5 % - 6 8 % ; 或杂木屑6 0 % ， 棉籽壳2 0 % , 鼓皮1 0 % ，玉米粉8 % ，石膏1 % , 葡萄糖1 % ,含水 量为6 5 % -6 8 % . 1 . 2 . 4 子实体培养 12 1 在裂褶菌的栽培研究中，所用培养料的配方较多，一般以 杂木屑、棉籽壳及 各利 ， 农作物秸杆为主料，加数皮、米糠、玉米面、石灰和少量微量元素( 如杂木屑 8 8 % , 鼓皮1 0 % ，石膏1 % ，石灰1 % ) 。春季大棚栽培， 栽培场所应选择在环 境清洁、 无污染、 通风良 好、四周开阔、 地势平坦的地方。可 采用熟料袋栽和瓶栽。 接种 后，置于2 5 2 8 0C 、空气相对湿度6 5 % 以下、黑暗或弱光的菇房中 培养2 0 d 左右， 菌丝即可发满菌袋。转入出菇阶段后，应保持菇房空气新鲜、9 0 % 左右的空气相对 湿度及适当的散射光照。开袋( 瓶) 后，应注意菇房卫生，防止病虫害发生。裂褶 菌采收后， 应及时包装 鲜销或加工处理。 在温度2 5 0C左右和湿度7 0 % 的室内环境条件下，如果培养料配方合适，接种 1 0 -1 2 d 菌龄的菌种( 7 d左右刚长满菌种培养基) ，菌丝在培养料上生长迅速。若 采用1 2 x 2 5 c m 的 塑料袋栽培， 一般接 种1 5 -2 0 d 就可以出 菇， 可采收三潮菇， 生物 学效率在3 5 % -5 0 % 之间。 1 . 2 . 5 深层发酵 国内 外己 经有很多 有关深 层发酵的报道。 李兆兰等L 1 3 ， 报道， 采用黄豆粉一 葡萄 糖液体培养基( 黄豆粉0 . 5 % ,葡萄 糖3 . 0 % ,酵母膏0 . 2 % ,磷酸二氢钾0 . 1 % , 硫酸镁 。0 5 % ) ， 在p H 5 -5 . 5 、 温度2 6 2 8 0C 、振速1 0 0 一1 1 0 r / m i n 条件下培养裂褶菌有 利于裂褶菌多糖合成。王凤仙 ， 们 的 研究表明， 三十烷醇可以 不同 程度地增加裂褶 菌深层培养菌丝球的产量; 钱秀萍等 15 对裂褶菌液体发酵( 液体培养基组成: 葡萄 糖5 g , 硝酸钱0 . 1 g , 磷酸二氢钾0 . 1 g ， 硫酸镁0 . 0 5 g , 氯化钾0 . 0 5 g , 碳酸钙3 g ) 。 培养时营养条件的研究结果表明， 裂褶菌在发酵培养基中产生苹果酸的最佳碳源 是葡萄糖， 果搪和麦芽 糖次之; 最佳氮源是牛肉 浸膏， 草酸钱和硝酸钱次 之， 磷酸 二氢钾和氯化钾对裂褶菌产酸影响 不大，而培养基碳酸钙浓度与 苹果酸产量成正 比。 方靖等, “ I 研究了 裂褶菌菌丝液体培养产生纤维二糖脱氢酶的 条件， 结果表明， 培养基中 加入唬拍酸钠缓冲液和土温8 0 有利于酶的 合成，黎芦醇或愈创木酚对酶 的生成没有影响， 而叠 氮化钠和氰化钾对酶活力有影响。 0 3 级硕十学位论文 第一部分裂褶菌化学活性成分研究 1 .3 裂褶菌生理活性研究进展 1 . 3 . 1 食用和药 用价值 裂褶菌幼时质嫩味美，具有特殊的浓郁香味，在云南是有名的食用菌，同时 又是我国著名的药用菌。其性平、 味甘，具有滋补强壮、 扶正固本和镇静作用， 可治疗神经衰弱、 精神不振、 头昏耳鸣和出 虚汗等症【 ， 。 在我国 西南诸省民间， 孕 妇分娩后，常用裂褶菌和鸡蛋煮汤食用，可促使产妇子宫 提早恢复正 常，并促进 产 妇分 泌 乳 汁。 国 内 外医 药 研 究 表明 ， 裂 褶 菌 子实 体中 含有 丰 富 的 有 机 酸和 具 有 抗 肿 瘤 作 用 的 裂 褶 菌 多 糖 ， 裂 摺 菌 的 浑 层 发 酵 产 lJ ( 菌 丝 体 ) 可 作 为 食 品 强 化 剂 添 加到多种食品中。 1 . 3 . 2 抗菌作用 裂褶菌子实 体和菌 丝体提取液对金黄色葡萄 球菌( S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 、 大 肠杆菌( E s c h e r i c h i a c o l i ) 、 痢疾杆菌( D y s e n t e r y b a c i l l i ) 、 枯草杆菌( B a c i l l u s s u b t i l is ) 以 及乙 型 副 伤 寒 沙门 氏 菌(S a lm o n e l la p a r a ty p h i B ) 具 有明 显 的 抑 制 作 用 17. 1.1 1 . 3 . 3 抗肿瘤作用和抗肿瘤机制 根据1 9 6 9 年日 本小松信彦教授的药理实验表明， 裂褶多 搪为免疫活性多糖， 能提高 细胞免疫功能，促进免疫球蛋白 的形成，刺激单核吞噬细胞系统的活性， 增强巨 噬细胞的吞噬和消化功能，增进迟发性皮肤变态反应，对荷瘤鼠的巨噬细 胞移动有抑制作用， 裂褶多糖对S a c o m a - 1 8 0 , S a c o m a - 3 7 , E h r l i s h C a r c i n o m a , Y o s h i d a S a c o m a 4 种动物实 验肿瘤有明 显的抑制作用 lu “ l l 小松信彦教 授对裂褶菌多糖的进一步 研究发现，该多糖对动物的急慢性感染 有 一 防御作用，能防御葡萄球菌、大肠杆菌，绿脓杆菌等多种细菌引起的 感染，能 显著增加脾脏产生抗羊红细胞抗体的细胞数， 并可增强迟发型皮肤过敏反应，提 高细胞免疫功能 2 2 - 2 5 1 9 7 4 年，日 本学者 N o b o r u N a g u m 。 等 人发现裂褶多糖与抗菌素联合使 用，则比 两药各自 单独使用时疗效更高。 它与 链霉素、 庆大霉素或者利福平联合使用起到 提高抗菌素效价，降 低抗菌素副作用的理想效果( 2 6 8 0 年代，日 本已 将裂褶多糖试用于临 床治疗一些以消化道癌为主的胃 癌、 胰 腺癌及直肠癌等，结果证明，裂褶多搪作为一个免疫治疗剂对进行性癌是有效果 的。在对癌性胸 膜炎的治疗过程中几乎全部患者在1 -2 个月后胸水均有淋巴 细胞 及巨噬细胞出 现，虽然胸水没有消失，但癌细胞变性、 消失 或明显减少圈。 现在， 日 本 已 用裂 褶 菌 多 糖 制 成了 药 品， 产品 称为 S c h iz o p h y lla n ( 中 文 名 “ 施 佐非兰” ) ， 可治疗子宫癌， 能明显增强患 者的免疫能力。 用裂褶菌多 糖进行肌肉、 腹腔或静脉注射均可发挥其免疫作 用，表现出高度的 抗肿瘤活 性 ， P - I) 0 3级硕士学位论文 第一部分裂褶菌化学活性成分研究 1 9 8 5 年， T a k a s h i 等 人 927研 究 裂 褶 菌的 结 构 与活 性的 关 系， 得 到以 下 结 论: 水 溶性的裂褶菌多糖对于小鼠 S a r c o m a 1 8 0 的抗癌活性和存在于溶液中的单链及三螺 旋结构多糖的数量相对应， 如果水溶液中含有低于5 0 % 三螺旋结构多糖， 就没有显 著的抗癌活性。 裂褶菌多搪因具有较好的抗肿瘤活性引起了国内外学者的关注，不仅研究野 生 裂褶菌的多糖， 对人工培养裂褶菌发酵液和菌丝体中的裂褶菌多 糖也做了 大量 活性研究。国内 文献也有对裂褶菌多 糖研究的 相关 报道。1 9 9 0 年， 夏东等人【 28 1 分 别 从发酵培养的裂褶菌菌丝体和发酵液中 提取得到裂褶菌胞内多 糖( S P G , ) 和胞外 多 糖( S P G , ) 。 研究发现S P G 和S P G 2 均能显著促进C o n A 诱导的 小鼠 脾淋巴 细胞增殖反 应。S P G , 还显著地对抗氢可的松对淋巴细胞增殖反应的抑制作用。S P G ， 和S P G : 均可 恢复1 4 月龄老年小鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应。小鼠腹腔内( 工 P ) 给药，S P G . 和 S P G ， 均能显著增强二硝基氯苯 ( D N C B ) 所致小鼠迟发型皮肤过敏反应( D C H ) 。小鼠腹 腔内( I P ) 给药S P G ， 可显著增强 羊红细胞( S R B C ) 诱导的小鼠 脾脏空斑形成细胞( P F C ) 反 应。 S P G .和S P G : 还可使老年小鼠 的P F C 反应恢复至成年小鼠 水平。 1 9 9 4 年，李兆兰 u 报道了 裂褶菌多糖具有促进网 状内皮系统机能的作用， 可 增强巨噬 细胞的吞噬活性，对巨噬细胞、自 然杀伤性T 细胞有激活作用， 能提高白 细 胞介素产生能力。当使用剂量为1 . 2 5 -1 . 5 m g / k g 时， 对大鼠 移植性肉瘤5 2 3 7 及 肉 瘤5 1 8 0 的 抑制率可达 8 7 % ;当 使用剂量为 0 . 7 m g / k g 时，对艾氏腹水癌的 抑制率可 达7 4 % ; 使用剂量为 0 . 5 m g / k g 时， 对动物( 小鼠、 大鼠、 仓鼠 、 狗) 同系肿瘤如M M 2 4 6 乳癌、 腺癌7 7 5 等小鼠 移植性肿瘤， B C 2 4 7 膀肤癌、 S M T 2 5 维肉 瘤等大鼠 移植性肿瘤 以 及E N N G ( N 一 乙基 一 N 一 硝基一 N 一 亚硝基9) 诱发的狗胃 癌具有一定的抑制作用。此 外，裂褶菌多糖与 a、p、Y射线并用后，经组织检查发现，肿瘤部位淋巴细胞 高度浸润，纤维化间质增强。 1 9 9 7 年，天津师范大学生物系邵伟2 9 1 研究了 不同 剂量的野生裂褶菌多糖对抗 肿瘤活性的影响。 证明 适宜剂量的 野生裂褶菌多糖， 对实体瘤生长有显著的抗瘤 作用，例如，每天腹注1 0 m g / k g ，对艾氏实体瘤生长呈现出显著的抑瘤作用，抑瘤 率达6 3 % r 但是，当 给带瘤鼠的多 糖剂量太小或过大时，其抑瘤效果刚呈现下降 趋 势;例如，娜次腹注剂量为0 . 5 m g / k g ，抑瘤率下降为3 4 % ，每次 腹注为5 0 m g / k g , 其抑瘤率仅是1 9 % a 1 . 3 . 4 其他作用 裂褶菌的 液体发酵物含有活 性较强的纤维素酶， 并能产生苹果酸， 菌丝深层 发酵时产生的 大量有机酸和促生长素叫噪乙酸， 均广泛应用于食品 工业、生 物化 学和医药卫生等领域(3 q 0 3 级硕士学位论文 第一部分裂褶菌化学活性成分研究 1 .4 裂褶菌化学成分研究进展 从1 9 3 0 年至今的 C A 文献检索来看，裂褶菌多糖 S P G ) 具有 较高的 抗癌免疫活 性，是国内外研究的热点，而对于裂褶菌的其它化学成分的研究报道较少。 1 . 4 . 1 多搪成分研究 1 .4 .1 .1 真 菌多 糖 成 分 研究 概 述 多 糖 是 组成 生 物 高 分 子家 族中 的 一个 很 丰 富多 彩 的 成员 ， 它是由 多 个 单 糖分 子以 糖普键结合而成的 天然高分子化合物，己 知的天然多糖化合物约有3 0 0 多 种， 广 泛 存 在于 植 物 、 动 物 和微 生 物 组 织中 ， 具 有多 种重 要的 功 能 。自 上 个世 纪 6 0 年 代以来，由于分子生物学、细胞生物学、膜的化学功能、免疫物质的化学研究与 发展以 及新药物资源的寻找与研究等，发现多 糖及其缀合物参与细胞的各种生命 现象的 调节，是细胞表面对各种抗原和药物的受体， 因此多搪作为支持组织和能 量来源的 传统观念已 被突破。 越来越多的研究证明: 多糖可作为 广谱免疫促进剂， 具有免疫调节功能， 还具有抗感染、抗放射、 抗凝血、降 血糖、降血脂， 促进核 酸与蛋白质的生物合成作用;能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。 所以，多 糖在治疗代谢、感染及癌症等疾病方面的应用不断 增加，可以 展望，多 糖研究将成为分子生物学、 药学中不可缺少的 组成部分， 甚至有些科学家预言: “ 今 后数十年将是多 糖时 代”(.34 - 3 i 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中 分离出的，能够控制细胞分裂 分化，调节细胞生长衰老的一 类活性多糖( 3 B ) 。 与动、 植物多糖不同， 真菌多 糖分 子单体之间， 大量地以( + ( 1 - - 3 ) 与0 ( 1 - - 6 ) 糖昔键结 合，形成链状分子， 具有螺 旋状的立体构型 3 4 ) 。 科学研究 表明真菌多糖在免疫功能的调节，癌症的诊断与治 疗，抗衰老及解除机体疲劳 等方面都有着重要的 作用。目 前，日 本及欧美等国 在 真菌多糖的研究方面处于领先 地位，我国的 真菌多 糖研究也有很大的进展。 真菌多糖的 结构分析包括 对其一级结 构和高级结构的分析。 真菌多糖的一级 结构分析是对单 糖组分， 糖基连接方式、 糖普键的构型及不同 普键组成比 例等的 分析。 在单糖组分的分析中，先对多糖进行完全水解，再用纸层析、薄层层析、 气相层析等方法 进行鉴定;在糖基连接方式的分析中，采用甲 基化分析法、高碘 酸氧化法、S m i t h 降解法、 核磁共振等方 法;在搪昔键构型的 分析中， 采用糖昔酶 水解、核磁共振、质谱等方法;对不同 糖昔键比 例的分析通过测红外光谱相对面 积来完成。对一级结构的分析，除以上各种方法外，目前还有毛细管电泳、快原 子轰击质谱、同 位素、免疫化学法、拉曼激光光谱等方 法。目 前， 对真菌多糖高 级结构的分析还没有深入， 测定方法还未达到象核酸和蛋白 质结构测定那样自 动 化、微量化和标准化，现在主要是应用物理方法进行分析，如X 一 射线衍射、核磁 0 3级硕十学位论文第一部分 裂褶菌化学活性成分研究 共振、电 子衍射等14 a ) 表 1 - 1 部 分 真 菌 多 糖 的 来 源、 结 构 及 主 要 生 物 活 性 t41- 497 T a b . I 一 1 T h e s o u r c e s , s t r u c t u r e s a n d b i o a c t i v i t i e s o f s o m e f u g i 多 糖 名 称真 菌 米 源结 构主要生物活性 香菇多搪L e n t in u s e d o d e s s ( 1 - - 3 ) ( 1 -6 )葡聚糖 LA芝多糖C o r i l u s v e r s i c o l a r 尺芝多糖G a n o d e r m a l u c id u m 金针菇多糖F l a mmu li n a v e l u t ip s 伙荃多糖P o r ia c o c o s 银耳多糖T r e me l l a f u c if o r mi s 6 ( 1 -4 ) ( 1 -6 )葡聚糖、 糖肤 0 ( 1 -3 ) 0 -4 ) 0 - - 6 ; 葡聚糖、葡萄糖肤 N ( 1 -3 )葡聚糖、半乳糖、 目 一 露搪 0 ( 1 -3 )葡聚糖 0 ( 1 .3 ) ( 1 -6 )葡聚糖 抗肿瘤，免疫调节，增加 D N A的合成和外单核免疫 球蛋白的产生 免疫调节，抗肿瘤，抗辐 射，降血脂 降血糖，免疫调节，抗肿 痛 ，杭 衰 老 抗肿痛 黑木耳多糖A u r ic u la r ia a u r r i c u la葡萄糖、甘露糖 抗肿瘤 降血脂，免疫调节，抗辐 射，抗炎症，抗肿瘤 降血糖， 免疫调节， 抗肿痛 S c h iz o p h y l lu m 裂 褶 多搪 抗肿瘤，免疫调节 猪 等 多糖P o ly p o u r s u mb e l la t u s抗肿瘤，免疫调节 羊肚 菌 多糖 M or c h e l l a e s c ul e n t a降血脂，抗肿瘤 竹荪多糖 猴 头 多糖 d ( 1 -3 )葡聚搪 d ( 1 -3 )葡聚糖 葡萄糖、1 1 -10糖、果糖、海藻 糖 1 士 簇糖、半乳糖、葡萄糖 杂多糖 杭肿瘤，降血脂 降血糖， 免疫调节， 抗肿瘤 金顶侧耳 令耳多糖 冬虫夏草 多糖 很 U 耳多糖 Dic ty o p h o r a i n d u s i a t a H e r i c iu m e r i n a c e u s P le u r o t u s c it r i n o p i le a tu s F mm e l la a u mn t ia l b a 半乳目 一 露聚糖 抗病毒 甘露糖、半乳糖、葡萄搪免疫调节，降血脂 C o r d y c e p s s p I 甘露搪、葡萄糖免疫调节，抗肿瘤 P le u r o t u s o s t r e a t u s S ( 1 .3 )葡聚搪免疫调节 真菌多 糖分为水溶性和水不溶性多 糖。水溶性的多糖 采用热水浸提，时间、 重复次 数视不同真 菌而定。水不溶性多糖用酸或碱提取， 常用三氯乙 酸、 稀盐酸、 草酸钱、氢氧化钠等。用 碱提取时，为防止多糖降 解，常加入硼氢化钠或硼氢化 0 3级硕十学位论文 第一部分裂摺菌化学活性成分研究 钾。目 前， 提取真菌多糖时先用1 0 0 热水浸提， 提出 水溶性部分， 残渣继续用酸、 碱处理。 在提取多糖之前，可用酶、 超声波或低温冻融等方法使细胞破碎，用乙 醇等有机溶剂除去材料中的脂类物质并 减少多糖降解。水提取液经离心、 过滤， 减压浓缩后，加入乙 醇沉淀多糖， 不同 浓度的乙醇可沉淀出不同组分的多糖。沉 淀相继经乙 醇、 丙酮、乙 醚洗涤， 再经流水透析再冷冻干燥， 可得到多糖粗制品， 需研究多糖抑瘤活性时以流水透析再冷冻干燥为好。多糖制品若需除去蛋白 质， 可 用 S e v a g 法 除 去。 多 搪 粗 制品 顺 序经 D E A E 纤 维 素 柱 层 析， 凝胶 过 滤 ， 吸 附 层 析 便 可分离出各种组分的纯多糖。经分离纯化后的 真菌多糖需进行纯度鉴定， 现在常 用的纯度鉴定 方法有超离心法、高压电泳法、 旋光测定法、凝胶层析法、高压液 相法等。必须指出， 纯度检查要求有上述两种方法以上的结果才能肯定3 6 7 真菌多糖普遍具有较高的生物免疫活性， 如抗肿瘤、 降血脂、抗病毒、抗衰 老、抗辐射等作用。 表1 - 1 列举了部分真菌多 糖的 来源、结构及主要生物活性。 1 . 4 . 1 .2 裂摺菌多糖( s c h i z o p h y l l a n ) 1 9 6 9 年， N K o m a ts u 1 7等人 从 裂 褶 菌中 分 离 提 取 得到 多 糖 成 分( s c h iz o p h y lla n ) 以下简称S P G ， 并发现该多 糖成分具有抗癌活性。 1 9 7 0 年， K i k u m o t o “ “ 7 等人从 裂褶菌人工培养液中同 样分离 提取得到S P G ， 并证 明 其结构为是以葡萄糖为单一组分的0 一 ( 1 - 3 ) 一 葡聚搪，其中 每3 个葡萄糖分子 上 连有一个 0一 ( 1 - 6 )的分支，平均分子量约为4 5 0 0 0 0 S P G ( s c h i z o p h y l l a n ) 1 9 8 5 年，T a k a s h i 等人3 2 7 应用光散射， 沉降、粘度测定和生物鉴定等检测方法 研究裂褶菌的结构，得到以 下结论: 在稀水溶液中，如果重量平均分子量大于9 x 1 0 0 , 裂褶菌多糖的结构就为 棒状的三螺旋结构， 间距为0 . 3 0 n m ， 直径为2 . 6 n m ，长 度为 2 0 0 n m 。在水和二甲亚矾的混合溶液中，当水的含量降低至1 3 % ，三螺旋就会 0 3 级硕十学位论文 第一部分裂褶菌化学活性成分研究 离 解为三条 任意链。 在重量平均分子量小于9 X 1 0 “ 时， 三螺 旋结构 和单链结构同 时 存在于水溶液中， 如果重量平均分子量继续降低至5 X 1 0 ， 三螺旋结构将随之消 失。 1 9 9 0 年，夏东等人分别从人工培养的裂褶菌的菌丝体和发酵液提取并纯化的 两 种多 糖S P G .和S P G , ，分子量分别为1 0 万和7 万。 化学结 构均为 主链0 ( 1 - 3 ) 结合， 支链0 ( 1 - 6 ) 结合的 葡聚糖。 性状均为 黄褐色粉 末， 溶于 冷水， 热水可加速其溶解， 水 溶 液 呈 粘 稠 透明 状， p H 6 . 9 - 7 . 0 0 1 9 9 4 年，李兆兰等人提取得到胞内多糖S P G ，化学结构也为主链 0 ( 1 - 3 ) 结合， 支链P (1 - 6 ) 结合的葡聚糖。白 色、 纤维状、 溶于水， 粘绸。 不溶于高浓度的乙 醇、 乙醚、丙 酮，乙 酸乙酷 等有 机溶剂，p H 中性网。 1 . 4 . 2 裂褶菌其他化学 成分研究进展 裂褶菌含有纤维素酶，能 产生苹果酸( L - m a l i c a i d ) ， 菌丝深层发 酵时，能大 量产生有机酸， 还可产生促生素A E I 噪乙酸 3 1 1 。 其它化学成分如下: 裂褶菌制素( s c h i z o s t a t i n ) 1 9 9 6 年， T a n i m o t o T 等人从裂褶菌中 分离得到新的鳖 烯合成酶强效选择性抑制 剂裂褶菌制素( s c h i z o s t a t i n ) ，并通过烯丙基澳与钡试剂高度区域和立体选择性 偶联反应实现了 全合成r 丈 。 S ch i z o s t a t i n 海藻糖( t r e h a l o s e ) 和麦角固醇( e r g o s t e r o l ) 早 在 1 9 4 8 年， H id e y u k i 等 人 从 裂 褶 菌中 分 离 得到 海藻 糖( tr e h a lo s e ) 和麦 角 固 醇 ( e r g o s t e r o l ) . t r e h a l o s e e r g o s t e r o l 通过文献检 索发现， 裂褶菌的化学活性成分除裂褶菌多 糖外， 其他类化合物 的 报道较少，有可能发现其他具 有生 物活性的化学成分， 有待深入研究。 0 3级硕士学位论文第一部分裂褶菌化学活性成分研究 1 .5 课题来源及选题意义 本文的研究工作为云南大学与云聋公司联合课题。 裂褶菌广布于我国各地，云南采食裂褶菌的历史 悠久， 为高档食药用菌。日 本及欧美等国对裂褶菌抗癌活性多糖成分和优良 菌株的选育等方面的研究比 较活 跃 。 现 在，日 本已 用裂 褶 菌 多 糖 制 成了 药 品， 产品 称为 S c h iz o p h y lla n ( 中 文名“ 施 佐非兰”) ，可治疗子宫癌，并能明显增强患者的免疫能力。 文献检索， 世界上有野生裂褶菌多 糖成分的结构、活性以及人工驯化等方面 的大量报道.其 它化学成分的报道较少。 2 0 0 3 年，罗星野等人用野生的 菌种实现 了 裂褶菌的引种驯化人工培养子实体成功，这在世界上尚属首次。 本文的研究工作是在罗星野等人工作基础上， 对野生及人工培养裂褶菌的多 糖成分进行对比 研究，同时 对二者的化学成分进行分离、鉴定，寻找其它活性成 分。因此，该工作的研究意义是显而易见的。 1 . 6 本文的主要研究工作 本文的 主要研究工作可分为以 下四大部份: 1 . 6 . 1 裂摺菌的 驯化及规模化栽培 概述利用野生的菌种进行裂褶菌的引 种驯化及规模化人工培养裂褶菌子实体 的情况。 1 . 6 . 2 裂褶菌的 营养成分研究 裂褶菌为高档食药用菌，本文主要对野生和人工培养裂褶菌的营养成分进行 对比研究。 1 . 6 . 3 裂褶菌的多糖成分研究 参考多 糖研究方法， 对分离纯化的野生及人工培养裂褶菌多糖进行对比 研究。 1 . 6 . 4 裂褶菌的化学成分研究 参考传统的 天然产物研究方法，采用溶剂提取、 柱层析等化学手段分离提纯 的野生及人工培养裂褶菌中的 化学成分， 进行结构鉴定。分析野生 及人工培养裂 褶菌化学成分的差异。 0 3 级硕十学 位论文 第一部分裂褶菌化学活性成分研究 第四章裂褶菌多糖的分析研究 裂褶 菌多糖是由 裂褶菌分泌的 胞外多 糖， 具有R - ( 1 - 6 ) 分支的(i - ( 1 - 3 ) - D葡聚糖 的 独特的活性结构和良 好的水溶性， 在调节免疫功能、 抗肿瘤、 抗辐射等方面有 着显 著的 疗效29 。王森 4 8 1 在文献中 报道因 裂褶菌素具有独特的 结构， 其生物活性 高于其他真菌多糖。 2 0 0 3 年， 罗星 野利用野生的 菌种首次实现了裂褶菌的引种驯 化并人工培养子实体成功。 本论文对人工培养及野生裂褶 菌的多糖成分进行了分析测定，初步对比 研究 探讨二者的多糖成分的差异。 4 .1 实验部份 4 . 1 . 1 材料 野生裂褶菌，2 0 0 5 年1 月购于昆明干菜市场，产地:云南; 干 燥人工培养裂褶菌子实体: 2 0 0 5 年1 月，昆明云 覃科技开发有限责任公司 提供; 样品6 0 烘干，供测定使用，其余低温保鲜备用。 4 . 1 . 2 试剂及仪器条件 4 . 1 . 2 . 1 试剂 S e p h a d e x G - 2 0 0 ， 兰 色葡 聚 糖 2 0 0 0 均 为 P h a r m a c ia 产品 : 半透膜，产地:美国: 葡萄搪、 甘露糖、木糖、半乳糖、 阿拉伯糖、 果糖、半乳糖标准品为进口 或 国 产生 化试剂;其它试剂均为国 产分析纯 试剂。 4 . 1 . 2 . 2 仪 器 7 5 1 紫外分光光度计 ( 工作条件:波长: 3 5 0 士 I m n石英皿:l e m ，上海第一 仪 器 一 ) A V A T A R F T 一 IR 红 外 分 光光 度仪 不 B r 压片 ) B r u k e r - A M 5 0 0 M 核磁共振仪 S h i m a d z u U V 2 0 0 0 紫外可见分光光度计 4 . 1 . 3 多 糖提取 于 燥 野 生 裂 褶 菌 子 实 体 ( 3 5 0 g ) 及 人 工 培 养 裂 褶 菌子 实 体 ( 6 0 0 8 ) 用甲 醇 脱 脂， 凉 干，再用沸水提取3 次， 每次4 h ， 合并 水提取液， 浓缩至小 体积，用乙醇沉淀， 0 3 级硕十学位论文第一部分裂褶菌化学活性成分研究 沉淀 物用乙醇洗涤数次， 热水溶解， 滤去杂质， 浓缩， 干 燥， 获粗多糖。 从野生 裂褶菌中分