水通道蛋白与慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期的研究-耳鼻咽喉-头颈外科硕士论文

同济大学医学院 硕士学位论文 水通道蛋白与慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期的研究 姓名：方旭华 申请学位级别：硕士 专业：耳鼻咽喉-头颈外科 指导教师：葛荣明;毛涌 20090501 摘要 摘要 目的：1 ) 观测嗜酸性粒细胞在正常下鼻甲和不同分型鼻息肉中的表达情 况：2 ) 明确水通道蛋白一l ( A q u a p o r i n 一1 ，A Q P - 1 ) 和水通道蛋白一3 ( A q u a p o r i n 一3 ，A Q P 一3 ) 在J 下常下鼻甲组织中的表达分布；3 ) 观测水通道蛋白一l 和水通道蛋白一3 不同分型分期的鼻息肉中的表达情况；4 ) 初步探讨水通道蛋白 一1 和水通道蛋白一3 在维护正常岛生理功能及在鼻息肉发病中的作用机制。 方法：1 ) 取鼻息肉组织2 8 例，按1 9 9 7 年海口慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型 及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准分为：I I 型l 期9 例，2 期7 例，3 期7 例，I I l 型 5 例；取鼻中隔偏曲矫正术下鼻甲代偿性肥厚患者术后下鼻甲粘膜组织7 例：2 ) 上述标本均采用4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，H E 染色，病理证实。 对所有的标本进行嗜酸性粒细胞计数，应用免疫组织化学技术检测A Q P 一1 和 A Q P 一3 在正常下鼻甲粘膜组织和不同类型鼻息肉中的表达及分椎。 结果：1 ) 正常下鼻甲粘膜组织中的嗜酸性粒细胞表达低于鼻息肉组织 ( P ( O 0 5 ) ；2 ) 在粘膜上皮层，鼻息肉组织A Q P - 1 和A Q P - 3 阳性细胞数均显著 低于正常下鼻甲组织( 户 O0 5 ) ： 在粘膜上皮层，鼻息肉组织A Q P 一3 阳性细胞数显著低于正常下鼻甲组 第3 章结果 织( P O 0 5 ) ，I I 型2 ，3 期鼻息肉阳性细胞数之间无显著性差 异( 尸= O 8 4 8 ，P 0 0 5 ) ； 在粘膜上皮下固有层腺体和血管内皮，鼻息肉组织A Q P l 阳性细胞数 显著高于J 下常下鼻甲组织( P O 0 5 ) ，1 I 型2 期与l l 型3 期鼻息肉的阳 性细胞数差异没有统计学意义( P = - O 1 9 9 ，P 0 0 5 ) ，I I I 型鼻息肉阳 性细胞数与I I 型2 期的阳性细胞计数有统计学差异( P = - O 0 2 2 ，氏 0 0 5 ) ，I l l 型鼻息肉阳性细胞数与I I 型l 期的阳性细胞计数有统计学 差异( P = - O 0 0 3 ，P O 0 5 ) 。 1 3 第4 章附图 第4 章附图 图1 嘈酸性粒细胞在正常下鼻甲 组织中的表选( 呱染色4 0 0 ) 蕊辫j I 、： 图3 嘻酸性粒细胞在型鼻息内组 织中的表达( 1 f f i 染色2 0 0 ) 、 图0 珊，一1 在正常下鼻甲粘膜上皮层 的表达( 免疫组化s 日c 法，X 2 0 0 ) ， 一- 矿 圈2 嗜酸性粒细胞在型l 期鼻息内 组织中的表达( 脏染色，4 0 0 ) 囤4 嘈酸性粒细胞在型2 期鼻 息内组织中的表达( 陋染色4 0 0 ) 图6 。P l 在型I 期鼻息内粘膜上皮 层的表达( 免疫组化$ A f i C 法，4 0 0 ) 第4 章附图 嚣、 圈7A Q P3 在正常F 鼻甲粘族上皮 层的袁选( 免疫组化s B c 法，2 0 0 ) 图0 妒1 在型3 期鼻息肉上皮下 组织中的表选( 免疫组化s B c 法2 0 0 ) 幽8A o P _ 3 在型2 期鼻息内桔腆上皮 层中的表远( 免疫组化s B c 法4 0 0 ) 1 ：f 。1 C 广 图1 0A Q Pl 在l I 型3 期鼻息内上皮下 组织中的表达( 免疫组化S i S C 挂，x 4 0 0 ) 图1 1A Q P3 在型鼻息肉上皮下组织中 的表达( 免疫组化s A B c 法，x2 0 0 图他A 口P _ 3 在型鼻息内上皮下组织 中的表达( 免疫组化5 A B C 法，2 0 0 第5 章讨论 第5 章讨论 水是活细胞的主要组成部分，在活细胞中，水的比例占总量的7 0 左右。细 胞内外水平衡的稳定是维持生命的关键因素之一。 近年发现水通道蛋白( A q u a p o r i n ，A Q P ) 在介导自由水被动跨膜转运，维持 细胞内外环境的稳定平衡中具有特殊的作用。水通道蛋白家族是一组分子量约为 ( 2 7 3 1 ) 1 0 的小分子膜蛋白，它广泛存在于哺乳动物的体内。由于它的发现和 在染色体上的定位，使人类对某些疾病有了新的认识。水通道蛋白是一类高度保 守的蛋白，各种亚型之间具有非常相似的蛋白序列及三维结构。冰冻蚀刻和电镜 技术发现，水通道蛋白主要以同源四聚体的形式存在，这四个亚单位均独立构成 孔道结构，并且可以完成水通透等生理功能。生理情况下，水通过细胞膜包括磷 脂双分子层的简单扩散和通过水通道蛋白的快速转运两个过程1 。 鼻息肉是耳鼻咽喉科的常见病，它作为一种特殊的炎症和水肿组织，有着复 杂的发病机制。近2 0 年来，随着对鼻息肉病理生理学的研究，以及内窥镜手术 和各种类固醇药物在临床的广泛应用，鼻息肉的疗效已明显改观，但临床上复发 的鼻息肉患者并不少见。因此有必要更加深入的研究其发病机制，设计出相应的 治疗新方案，从而更好的指导临床治疗。 5 1 鼻息肉发病机制的探讨 鼻息肉( N a s a lP o l y p s ，N P ) 是临床常见病，发病率较高，约占人口总数的 1 - 4 ，术后复发率约为1 0 - 2 0 m 1 。鼻息肉由高度水肿的异粘膜构成，上皮为假 复层柱状上皮，也有部分上皮化生为鳞状上皮，下为水肿的疏松结缔组织，其问 有嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞，肥大细胞，无血管，无腺体， 无神经支配。一般根据组织学分为四型u 刳，最常见的类型是水肿型，约占总数的 8 5 一9 0 ，水肿型鼻息肉的形态学特点是组织水肿，上皮杯状细胞增生，基底膜 增厚，大量白细胞，特别是嗜酸粒细胞浸润。第二种组织学类型为纤维炎性鼻息 肉，特点是慢性炎症及重叠上皮( o v e r l y i n ge p it h e li u m ) 的化生改变。第三种类 型较为少见，特点是浆液粘液性腺体的显著增生。第四种类型息肉非常罕见，表现 为具有不典型的基质。鼻息肉为多侧发病，单侧较少，所以常表现为双侧鼻塞并 逐渐加重为持续性，息肉体积增大后可完全阻塞鼻通气；还可能伴有鼻溢液，嗅 觉功能障碍，听力减退，耳鸣等。 近年来，耳鼻喉科学者之所以对鼻息肉产生浓厚兴趣，主要由于对鼻息肉治 1 6 第5 章讨论 疗的多样化，其中包括全身或局部皮质类固醇激素治疗；简单的圈套器切除；鼻 内窥镜下各鼻窦口的丌放等。合理的治疗必须建立在充分地明确该疾病的发病机 理上，但鼻息肉的病因，发病机制至今未明，所以，疗效均不理想，复发率高。 多数研究认为，鼻息肉是与多种病理状态相关的炎症过程的最终结果，这表明多 种病因、多种途径、多种介质参与此病理过程。现已证明参与鼻息肉病病理过程 的炎症化学介质多达数十种甚至上百种，如组胺、血小板激活因子、花生四烯酸 代谢产物( 前列腺素、白三烯等) 、去甲肾上腺素、神经肽Y 、P 物质、血管活 性肠肽、转化生长因子、肿瘤坏死因子、粘附分子、白细胞介素、一氧化氮合成 酶、干扰素一Y 、干细胞因子、血管通透性因子等。1 9 9 7 年B e r n s t e i n 等在“上 皮破裂理论”的基础上提出了“多种因素发病学说”。其内容为，鼻腔外侧壁的空 气动力学变化，细菌、病毒以及变应性疾病等多种因素均可作用于鼻腔外侧壁粘 膜，引起粘膜的炎症反应。刚丌始，上皮破裂、粘膜疝出、再上皮化、新腺体形 成、鼻息肉形成。此时，鼻息肉组织中的结构细胞，如上皮细胞和成纤维细胞的集 落刺激因子可促进组织内嗜酸粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞的集聚。炎症反应 可影响粘膜上皮细胞N a + 、C l 一离子转运，即细胞N a + 吸收增多，C 1 一分泌增多。最终 导致进入细胞及| 日J 质的水分增多，细胞及问质水肿，鼻息肉组织得以维持并生长。 C a y e T h o m a s e n 等3 1 提出鼻息肉形成的四个阶段：局部上皮损伤；固有层的 纤维组织由上皮损伤处突出；突出组织的上皮化；息肉生长。 5 2 嗜酸性粒细胞与鼻息肉的发生发展 本实验的H E 染色标本显示：正常下鼻甲组织被覆假复层柱状上皮，其下为 薄层基底膜，以及由结缔组织构成的固有层，其间可见腺体和血管分布，固有层 问质中可见炎性细胞浸润。( 图1 ) 鼻息肉组织上皮符合呼吸道假复层柱状上皮 的特点，部分区域可见鳞状上皮化生，基底膜增厚，问质水肿，并伴有不同程度 的炎性细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞，淋巴细胞，肥大细胞和中性粒细胞。嗜酸 性粒细胞多见于鼻息肉组织固有层问质中，上皮粘膜层亦可见少量分布。( 图3 ) 。 鼻息肉中大量嗜酸性粒细胞在粘膜和粘膜下聚集，提示其在鼻息肉的病理生理学 过程中可能有重要作用：损伤上皮，释放炎性介质，细胞因子的激活。嗜 酸性粒细胞一般占外周血细胞的比例低于1 0 ，但其对致炎因子和变应原引起炎 症反应的作用相当重要。组织中大量嗜酸性粒细胞被激活，粘附于血管内皮细胞 壁并且穿过内皮层，同时释放与上皮损伤、脱颗粒有关的碱性蛋白如：二磷酸亚 甲基( M D P ) ，嗜酸性细胞阳离子蛋白( E C P ) 。同时，产生作用于血管的介质( 如 血小板活化因子) ，导致粘膜水肿。此外它还可以使细胞因子活化，刺激上皮增 1 7 第5 章讨论 生和化生，成纤维细胞增生，基质生成，新血管形成从而导致息肉的发生和发展。 近年来研究表明嗜酸性粒细胞，特别是鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞，可以合成、 释放多种强有力的调节分子一细胞因子，如G M - C S F 、T N F a 、T G F - B 、I L 一3 、 I L 一4 、I L 一5 、C D 4 0 等。其中部分细胞因子，如G M C S F ，T N F Q 及I L - 4 ，可以直 接或问接地反过来促进嗜酸性粒细胞的集聚及活化，I L 一3 、I L 一5 、G M C S F 还具 有抑制嗜酸性粒细胞凋亡的作用。具有促进嗜酸性粒细胞的集聚、活化作用的因 子还有I L 一8 、R A N T E S 、P 一选择蛋白。此外，T G F Q 和T G F - B 在鼻息肉组织结构形 成中起到一定作用。以上研究表明嗜酸性粒细胞通过多种方式调节上呼吸道炎症 过程，且部分解释了嗜酸性粒细胞自我“永存“ 的分子机理。目f ； 认为慢性炎症 和变态反应是鼻息肉发病的两大要素；嗜酸性粒细胞的趋化，移行和凋亡的微环 境控制是鼻息肉形成的主要机制制。 有研究发现，8 0 的鼻息肉有较多的嗜酸性粒细胞浸润，提示鼻息肉与嗜酸 性粒细胞有密切关系。嗜酸性粒细胞表面带有丰富的调节免疫反应的受体，并且 是许多细胞因子的重要来源。鼻息肉中大量嗜酸性粒细胞在粘膜和粘膜下层聚 集，细胞内含有大量损伤组织的毒性蛋白，可损伤上皮组织，提示其在鼻息肉的 病理生理学过程中可能发挥重要的作用。鼻息肉组织中引起嗜酸性粒细胞增多的 可能机制有：鼻息肉上皮细胞和血管内皮细胞、成纤维细胞产生多种集落刺激 因子和白介素等，可以促进嗜酸性粒细胞聚集、活化及炎症过程；组织中嗜酸 性粒细胞凋亡受到抑制，导致其生存时间延长；前两种机制的共同作用。 本实验的结果发现：在正常下异甲粘膜组织中( 2 3 8 1 6 9 ) 的嗜酸性粒细 胞表达低于各型期鼻息肉组织( I I 型1 期3 9 2 3 5 2 ，I I 型2 期3 7 3 2 9 6 ， I I 型3 期6 3 3 2 8 7 ，I I I 型1 0 0 0 3 4 6 ) ( P O 0 5 ) ，我们认为，I I 型2 期和I I 型l 期为鼻息肉发生的起始阶 段，嗜酸性粒细胞的表达还不完全或者没有完全被激活，细胞和组织问的水转运 受到嗜酸性粒细胞所释放的炎症介质的影响还不是足够大，所以这两组并没有表 现出明显的统计学差异；我们推测，在鼻息肉发展的这个阶段，临床若能及时有 效的进行鼻用糖皮质激素的干预和治疗，及时控制嗜酸性粒细胞的活化和表达， 可以有效的控制鼻息肉的生长，早期有效的药物保守治疗可以取得较好的疗效。 因此研究鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞将有助于加深对鼻息肉病理机制的 了解，为以后进行嗜酸性粒细胞的相关基因干预、基因治疗鼻息肉提供参考价值。 5 3 水通道蛋白一1 与鼻息肉的发生发展 1 8 第5 章讨论 近年来，随着免疫学和分子生物学的发展，对鼻息肉的病因学研究不断深入， 已从组织细胞水平达到亚细胞和分子水平，但水通道蛋白与鼻息肉之间的相关性 研究国内外报道很少。水通道蛋白( a q u a p o r i n s ，A Q P S ) 是一组与水通透有关的 细胞膜转运蛋白，它是一种独立的水转运系统，广泛存在于动物和植物中，起着 水重吸收，液体分泌，维持细胞内外液体平衡作用。水转运通常是钠离子主动转 运形成细胞内外渗透压驱动水分子由低渗向高渗方向运动。 对A Q P 一1 的基础研究比较深入u5 1 ，发现A Q P 1 分子单体是一个含2 7 0 个氨 基酸左右的单肽链，含有6 个跨膜倾斜的Q 螺旋，电子低温晶体学研究表明， 这6 个0 螺旋形成桶状围绕着中央一个似孔的区域。在分子中有五个环分别连 接于相邻螺旋之间，坏上含有高度保守的天冬酰胺一脯氨酸一丙氨酸( A s n P r o A l a ，N P A ) 序列，该序列是水通道家族成员共有的特点。胞内、外相对的两坏下 沉至双分子层内，这样整个分子前后两部分在N P A 处折叠，其结果是A Q P 一1 分 子的中央形成一个漏斗形的结构，6 条长的贯穿膜的Q 螺旋围绕在它周围，形成 水跨越脂双层转运的途径，这就是所谓的“沙漏”模型6 。“沙漏”的两端丌口 于细胞膜的内外f | l i 侧，中央的通道管部分长约2 0 。A ，是开放的，最狭窄处水孔 直径约为2 8 。A ，恰好是一单个水分子直径大小，水分子可以单列跨越细胞膜 的双分子层流动，而阻止质子和其他小分子通过研究证明，水分子跨越细胞膜 的快速输运是可以通过细胞膜上的水通道蛋白实现的。D a n i e l aB o a s s a n 铂等通过 实验证实了该水孔使A Q P 具有c G M P 门控的阳离子通道的功能。一个A Q P - 1 水 通道蛋白分子每秒钟可以允许3 0 亿个水分子通过。水通道蛋白大量存在于动 物、植物等多种生物中。在哺乳动物中，水通道蛋白大量存在于肾脏、血细胞和 眼睛等器官中，对体液渗透、泌尿等生理过程非常重要。水通道蛋白的调节分长 时调节机制和短时调节机制。长时调节是指在基因转录水平上使水通道蛋白合成 增多，水通道蛋白的m R N A 和蛋白质表达增加；短时调节是指水通道蛋白在内环 境的某些因素的调节作用下，活性改变或者有效通道数量改变。由于水通道蛋白 的存在，细胞j 可以快速调节自身体积和内部渗透压。有研究认为，细胞膜上水 通道蛋白其证常功能的发挥与细胞膜上的N a + 泵及N a + - K - + A T P 酶的活性水平有 关。研究证实，鼻息肉上皮细胞钠离子通道存在异常改变，使钠离子回吸收增 多的同时可携带水分子进入组织问液，导致组织水肿，而水又可经过水通道蛋白 向高渗方向转运。这提示由水通道蛋白参与的细胞内外水平衡转运失衡，在鼻息 肉组织水肿发病机制中可能起一定的作用。 A Q P 一1 作为发现最早到分子量为2 80 0 0 的水通道蛋白，在体内分布极为广 泛，研究表明，A Q P l 表达异常或者调节失控与某些疾病的水肿密切相关。2 0 0 1 年国内关桂梅口哪等通过检测A Q P - 1 在水肿型鼻息肉和F 常下鼻甲组织中的表达， 1 9 第5 章讨论 发现A Q P 一1 在J 下常下鼻甲组织中主要表达于上皮表面纤毛细胞层和上皮基底细 胞层以及固有层的浆液性腺细胞；A Q P l 在鼻息肉组织中除浆液性腺细胞外，还 主要表达于上皮下毛细管及血窦内皮细胞，而上皮表面的纤毛细胞和基底细胞则 无表达或少量表达。A Q P - 1 在鼻息肉组织中的表达及分布提示了其病理改变与水 通透性有关。M o b a s h e r iAC 2 0 3 运用微阵列技术半定量地测定了正常人类组织中 A Q P 一1 的表达情况，证实了A Q P l 在内皮细胞和选择性水转运上皮的分布，同 时确认了A Q P 一1 在一些分泌腺体中的表达。2 0 0 6 年A l t u n t a sA 船门发现A Q P - 1 在 鼻息肉中的成纤维细胞有表达，特别是在上皮下区域，浆液粘液腺周边以及小静 脉的内皮细胞，证实了A Q P _ 1 在鼻息肉组织中的高表达，认为A Q P - 1 的高表达导 致了粘膜的水肿和鼻息肉的发生发展。M u l l e rC 2 2 1 发现A Q P - 1 在鼻毛细管上皮 细胞的表达下调后，通过阻止水通道的转运而防止原高渗分泌液的稀释，因此允 许大量高渗液的排出，造成局部粘膜的水肿。 本实验以免疫组化方法检测了A q u a p o r i n - 1 在正常下鼻甲和鼻息肉组织中 的表达，结果发现在正常的下鼻甲组织中，水通道蛋8 - 1 主要表达于粘膜上皮 层中，而在鼻息肉组织中上皮层表达却很少，差异具有统计学意义( P O 0 5 ) ， 并且I I l 型鼻息肉粘膜上皮层中的表达低于I I 型( P O 0 5 ) 。本实验也发现A Q P - 1 在鼻息肉组织的上皮下血管内皮细胞和腺体的表达明显高于正常下鼻甲组织( 尸 O 0 5 ) ，并且在I I I 型鼻息肉上皮下血管内皮细胞和腺体的表达高于I I 型( 尸 0 0 5 ) ，提示鼻息肉的病理尘理改变与水通透性有关，A Q P - 1 在鼻息肉的发展过 程中也发挥一定的作用。A Q P - 1 在下异甲组织中的表达对于维持正常的生理功能 有重要的意义。呼吸区鼻腔粘膜中富含粘液腺、浆液腺、混合型腺体及杯状细胞， 能产生大量分泌物，在粘膜表面形成一层随纤毛运动而不断向后移动的“粘液 毯”，其主要成分为水、无机盐、粘多糖、粘蛋白和溶菌酶。这些物质有助于纤 毛的运动，且具有保护纤毛的作用。鼻腔粘膜固有层的腺体，可以分泌大量稀薄 的水样浆液，通过粘膜上皮层的水通道蛋白转运至上皮表面，保持纤毛的F 常功 能。在鼻息肉组织中，A Q P - 1 在上皮下的腺体细胞高表达，导致大量的水样浆液 分泌，并且A Q P - 1 在上皮下毛细血管内皮高表达，导致血管通透性的增强，血浆 渗出，二者导致组织问液的增多。由于A Q P - 1 在粘膜上皮层表达较少致使组织间 液不能及时有效的运输至组织外，导致组织间隙中大量液体集聚，形成组织水肿， 最后的结果是局部组织张力增高，上皮破裂，损伤。按照T o s 的“上皮破裂理论”， 息肉丌始发生发展。 从本实验的分析结果可以发现，根据1 9 9 7 海口分型标准0 1 ，水通道蛋白一l 在粘膜上皮层中的表达，I I I 型鼻息肉的表达低于l I 型3 期( P O 0 5 ) ，I I 型2 期与I I 型l 期的表达 2 0 第5 章讨论 差异具有统计学意义( P 0 0 5 ) ，I I 型2 期与I I 型1 期的表达差异具有统计学意义( 尸 O 0 5 ) 。这样的统计分析结果与理论推论有不相符之处。按照理论我们可以推 断，按照海口标准，I I I 型鼻息肉是多发性鼻窦炎或全组鼻窦炎伴多发性、复发性 鼻息肉，可以认为I I 型3 期发展的下一阶段，A Q P - 1 在I I I 型鼻息肉的粘膜上皮层 中表达高于I I 型3 期( P O 0 5 ) ，但是在上皮下的腺体和血管中，I I I 型鼻息肉的 表达与I I 型3 期的表达差异却没有统计学意义( D O 0 5 ) ，与当初的理论推测结 果有不同之处。我们计划在下一步的实验中进一步增加标本量，以弥补标本量的 不足；另外，本实验并没有采用计算机自动计数，因为考虑到不同染色批次的标 本可能有不同深度的背景色，可能会影响到计算机采集到的灰度值，并且由于不 同批次的染色也可能会影响到计算机采集到的阳性细胞密度：我们认为人工的计 数方法可以避免由计算机自动计数产生的系统误差，优于计算机自动计数。 5 4 水通道蛋白一3 与鼻息肉的发生发展 对A Q P 一3 也有一定的基础研究，但是对其结构有不同的推测。A Q P 一3 的结构 都是通过和A Q P - 1 对比来推测分析其与功能上的联系，理化方法研究直接表现 其结构的文献还未见到。可以确认的是，高度保守的N P A 基序位于2 个短螺旋 相对的顶端，从2 个螺旋的顶端分别延生出一条氨基酸残基松散链分别回绕，走 向各自的膜面，由这两松散链参与构成的通道部分多为极性氨基酸组成，而由长 螺旋参与构成的通道部分多为非极性氨基酸组成，通道管可视为一半疏水，一半 亲水，这种结构对A Q P 一3 的功能起着关键性作用。水分子可以通过A Q P - 3 向高 渗方向移动，目前了解到组织细胞水的跨膜转运有两种基本方式：穿越膜脂质 双分子层的简单扩散；经A Q P 介导的水的渗透性转运。 A Q P 一3 是分子量为3 5 0 0 0 的膜蛋白，具有选择性过滤功能，不仅能转运水， 而且能转运尿素和甘油。A Q P 一3 在呼吸系统主要表达于鼻咽部，气管和支气管上 皮基底细胞膜，在保持上呼吸道水平衡中发挥重要作用，与肺内的液体转运及气 道湿化也有关。A Q P 一3 还分布于鼻甲和气管上皮下的分泌腺体内，参与腺体分泌 中的水份转运，A Q P - 3 也是哮喘发作时气道粘膜肿胀和气道阻塞等病理机制的重 要环节。1 9 9 9 年M a t s u z a k iP ”发现在呼吸道从鼻腔到肺内支气管的假复层纤毛 上皮中都有A Q P 一3 的表达，可以阻止水从上皮下的丢失。J u nE S 心们研究发现培养 的人类鼻上皮细胞表达水通道蛋白A Q P 一3 ，滤过膜上的培养物诱导了粘膜分泌细 胞和上皮细胞，并且受维甲酸和地塞米松的影响。2 0 0 6 年A b li m it 拉神发现鼻腔粘 2 1 第5 章讨论 膜的支持细胞和基底细胞中A Q P 一3 在维持嗅区感觉细胞的周围微环境有着重要 的作用。2 0 0 8 年T a n c h a r o e n 啪发现在慢性炎症期的犬齿龈上皮中A Q P - 3 的表达 明显增强，提示其与慢性炎症关系密切。H a r a - C h i k u m a 3 通过研究A Q P 一3 基因敲 除的小鼠，发现小鼠损伤的表皮修复能力明显减弱，并且小鼠的肿瘤细胞增殖减 缓。 本实验以免疫组化方法检测了A q u a p o r i n - 3 在正常下鼻甲和鼻息肉组织中 的表达，结果发现在正常的下鼻甲组织中，水通道蛋白一3 主要表达于粘膜上皮 层中，而在鼻息肉组织上皮层表达却很少，差异具有统计学意义( P O 0 5 ) ，并 且I I l 型鼻息肉粘膜上皮层中的表达低于l I 型( P O 0 5 ) 。A Q P - 3 在下鼻甲以及中 鼻甲组织的表达对维持其J 下常的生理功能具有重要意义。A Q P - 3 的表达差异提 示：水通道蛋白一3 在上皮层的大量表达有利于粘液、浆液的分泌，并顺利转运 到上皮表面的纤毛层，保持纤毛周围环境的湿润，利于粘膜表面纤毛的正常摆动。 本实验也发现A Q P 一3 在鼻息肉组织的粘膜固有层腺体表达明显高于诈常下鼻甲 组织( P O 0 5 ) ，并且在I I l 型鼻息肉粘膜固有层腺体中的表达高于I I 型( 尸 0 0 5 ) ，提示鼻息肉的病理生理改变与水通透性有关，A Q P - 3 在鼻息肉的发展过 程中也发挥一定的作用。在以往研究的基础上结合本实验，我们认为，A Q P 一3 在 粘膜固有层腺体的过度表达，导致大量的水样浆液分泌渗出，组织间液增多； A Q P 一3 在上皮层表达的减少，不利于液体的转运，致使分泌和渗出到组织间隙的 大量液体集聚。最后导致的结果是粘膜固有层极度水肿，局部张力增高，造成粘 膜上皮损伤，破裂。但是鼻粘膜具有自我修复能力，于是破损处边缘的上皮移行， 覆盖同有层。如果上皮再生不能很快的修复突出的固有层，固有层将继续增长， 那么息肉将形成，并建立血管蒂。同时鼻粘膜中的各种液体分泌物不能被转运到 粘膜上皮表面，造成“粘液毯”功能障碍，继发感染，变态反应等一系列变化， 使鼻腔局部微环境发生变化进一步促进鼻息肉的发生发展。 5 5 本次实验方法的选择 本次试验对F 常下鼻甲组织和各型期的鼻息肉组织的嗜酸性粒细胞进行 计数，并同时对水通道蛋白一l 和3 进行检测，便于进行横向的对比；本实验 水通道蛋白的计数并没有应用一贯采用的灰度值测量方法，因为考虑到不同批次 的染色切片有不同深度的背景色，可能会影响对灰度值产生影响，导致数壬I ：的不 准确性。本次实验对嗜酸性粒细胞和水通道蛋白的计数均是在2 位经验丰富的病 理科医师的指导下进行多次计数取其平均值，以保证数据的准确性。对鼻息肉 标本进行临床分型分期，有利于发现水通道蛋白一l 和3 在鼻息肉发展过程的表 第5 章讨论 达情况的动念变化过程，利于指导临床工作。出于伦理学可行性考虑，未能进 行自身对照，我们打算在下一步的实验中，召集一定数量的志愿者参与，结合自 身对照，使实验更具有晚服力。在临床上，对于鼻息肉的分型方法还有其他分 型方法，海口分型标准便于临床应用，分型明确。 5 6 展望 B a u m eB r u c e 啪1 报道，他们已经成功的建立了两个动物模型，在受过唾液腺 放疗的小鼠和猪体内导入A Q P 一1 的c D N A ，以解决唾液腺分泌减少的问题，而这 一实践正是通过利用A Q P 一1 高表达，用以增强水转运的作用，增强分泌腺的分泌 和水的及时转运排出。目前这一实验临床病人尚未开始，可以期待会有理想的效 果。 国内张勋等报道水通道蛋白一2 在正常下鼻甲组织主要表达于粘膜的固有 层的腺体细胞，部分炎性细胞及粘膜上皮细胞，水通道蛋白一2 在鼻息肉组织中 主要表达于上皮细胞，上皮下问质中的腺体和部分炎性细胞，并且鼻息肉组织上 皮层显著高于下鼻甲粘膜。P e d e r s e nP S 。砌3 通过实验发现，高渗透压通过作用于 鼻息肉组织中A Q P 一5 ，可以显著的增强异息肉组织中上皮细胞的水通透性，提示 鼻息肉的发生发展与A Q P 一5 的表达密切相关。国内李志海。川等发现，A Q P - 5 在鼻 息肉组织中固有层细胞毛细血管及血窦内皮细胞呈过度表达，在腺体表达减少， 提示A Q P 一5 在病理状态下对鼻息肉的形成有一定作用。 以上结论表明不同的水通道蛋白亚型之间有不同分布，也许存在不同的作用 机制。进一步研究证实水通道蛋白各亚型在人鼻粘膜不同部位分别起何种作用以 及如何发挥调节水转运等问题，将对鼻息肉的理解和治疗将有重要意义，针对不 同亚型的水通道蛋白的靶位治疗联合嗜酸性粒细胞的相关基因干预、基因置换是 今后的研究方向之一。 第6 章结论 第6 章结论 根据实验结果得出结论： 1 嗜酸性粒细胞在鼻息肉组织中大量浸润，与其发病有关。 2 A Q P 一1 和A q P 一3 在正常鼻粘膜组织的表达对维持其正常的生理功能具有重要的 意义。 3 与正常鼻粘膜组织相比，A Q P l 和A Q P 一3 在鼻息肉组织中的粘膜上皮层表达均 减少，而在固有层腺体中表达增多。 4 A O P I 禾1 3 A Q P 一3 在不同临床型期的鼻息肉组织中表达差异具有统计学意义，它 们的异常表达与鼻息肉的发生和发展密切相关。 参考文献 参考文献 【1 】A g r eP ，P r e s t o nG M A q u a p o r i nC H I P ：t h ea r c h e t y p a lm o l e c u l a rw a t e rc h a n n e l 【J 】P h y s i 0 1 1 9 9 3 ，2 6 5 ：4 6 3 - 4 7 6 【2 】H e y m a r m ，E n g e l 八A q u a p o r i n s ：P h y l o g e n y , s t r u c t u r e ，a n dp h y s i o l o g yo fw a t e rc h a n n e l s J N e w si np h y s i o l o g i c a ls c i e n c e 1 9 9 9 ，1 4 ：1 8 7 【3 1S u iH ，H a n B G , L e eJK e ta 1 S t r u c t u r a lb a s i so fw a t e rs p e c i f i ct r a n s p o r tt h r o u g ht h eA Q P l w a t e rc h a n n ef J 】N a t u r e 2 0 0 1 ，4 1 4 ( 6 8 6 6 ) ：8 7 2 8 7 8 1 【4 】4K i n gL s ，K o z o n oD ，A g r ePF r o ms t r u c t u r et od i s e a s e ：t h ee v o l v i n gt a l eo fa q u a p o f i nb i o l o g y N a tR e vM o lC e l lB i 0 1 2 0 0 4 ：5 ：6 8 7 “ - 6 9 8 【5 】5 M o r i s h i t aY ，S a k u b eY ，e ta 1 A q u a p o r i ns u p e r f a m i l y ( s u p e r a q u a p o r i n s ) e x p a n s i o no f a q u a p o r i n sr e s t r i c t e dt om u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m s J P h a r m a c o lS c i 2 0 0 4 ；9 6 ：2 7 6 2 7 9 【6 】李学佩等耳鼻咽喉科学【M 】第1 版，北京：北京人学医学出版社2 0 0 3 ，5 7 【7 】T o sM ，M o g e n s e nC P a t h o g e n e s i so fn a s a lp o l y p s J R h i n o l o g y 1 9 7 7 ，1 5 ：8 7 9 5 【8 】B e r n s t e i nJ M ，G o r f i e nJ , e ta 1 N a s a lp o l y p o s i s ：i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n db i o e l e c t r i c a l f i n d i n g s ：ah y p o t h e s i sf o r t h ed e v e l o p m e n to fn a s a lp o l y p s J A l l e r g yC l i nl m m u n 0 1 1 9 9 7 ， 9 9 ：1 6 5 1 7 5 【9 】田勇泉，孙爱华，等耳鼻咽喉头颈科学 M 】第6 版，北京：人比卫生i J ；版社2 0 0 4 ，7 7 【1 0 】中华医学会耳鼻咽喉科学分会，中华耳鼻咽喉科杂忠编辑委员会慢性鼻窦炎鼻息肉l 临 床分删及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准( 1 9 9 7 ，海口) I S 中华耳鼻咽喉科杂忠1 9 9 8 ，3 3 ：1 3 4 【1 1 】K i n gL s ，A g r eP P a t h o p h y s i o l o g yo ft h ea q u a p o r i nw a t e rc h a n n e l s A n n uR e vP h y s i o l J 1 9 9 6 ，5 8 ：6 1 9 6 4 8 【12 】K a k o iH ，H i r a i d eEAh i s t o l o g i c a ls t u d yo ff o r m a t i o na n dg r o w t ho fn a s a lp o l y p s A c t a O t o l a r y n 9 0 1 1 9 8 7 ，1 0 3 ：1 3 7 - 1 4 4 【1 3 】C a y e - T h o m a n s s o nA ，T o sM ，e ta 1 P o l y pP a t h o g e n e s i s - a h i s t o p a t h o l o g i c a ls t u d y i n e x p e r i m e n t a lo t i t i sm e d i a 【J 】A c t ao t o l a r y n 9 0 1 1 9 9 5 ，1 1 5 ( 1 ) ：7 6 8 2 【1 4 】B e r n s t e i nJ M ，G o r f i e nJ ，N o b e lB R o l eo fa l l e r g yi n n a s a lp o l y p o s i s ：Ar e v i e w J 1 O t o l a r y n g o lH e a dN e c kS u r g 1 9 9 5 ，11 3 ：7 2 4 7 3 2 1 1 5 】N i e l s e nS ，F r o k l i a e rJ ，M a r p l e sD ，e ta 1 A q u a p o r i n si nt h ek i d n e y ：f r o mm o l e c u l e st o m e d i c i n e P h y s i o lR e v 2 0 0 2 ，8 2 ：2 0 5 - 2 4 4 【1 6 lJ u n gJ S ，B h a tR V , e ta 1 M o l e c u l a rs t r u c t u r eo fa na q u a p o r i nc D N Af r o mb r a i n ：c a n d i d a t e o s m o r e c e p t o ra n dr e g u l a t o r o fw a t e rb a l a n c e 【J 】P r o cN a t lA c a dS c i U S A 1 9 9 4 ，9 1 ： 1 3 0 5 2 1 3 0 5 6 【17 1D a n i e l aB o a s s a ，w D a n i e lS t a m e r ，A n d r e aJ I o nC h a n n e lF u n c t i o no fA q u a p o r i n - 1 N a t i v e l yE x p r e s s e di nC h o r o i dP l e x u s T h eJ o u r n a lo fN e u r o s c i e n c e 2 0 0 6 ；2 6 ( 3 0 ) ：7 8 1 1 7 8 1 9 【1 8 】张欣欣，郭永清，张文杰等N a + 通道与鼻息肉形成天系的初步研究【J 】中华耳鼻咽喉科 杂，占2 0 0 0 ，3 5 ( 5 ) ：3 5 9 3 6 2 【1 9 】关梓梅，徐春玲，董震等水通道蛋白1 在鼻息肉组织中的表达f J 】中华耳鼻咽喉科杂忠 2 0 0 l ，3 6 ( 5 ) ：3 3 0 3 3 2 【2 0 】M o b a s h e r iA ，M a r p l e sD E x p r e s s i o no ft h eA Q P 1w a t e rc h a n n e li nn o r m a lh u m a nt i s s u e s ：a s e m i q u a n t i t a t i v es t u d yu s i n gt i s s u em i c r o a r r a yt e c h n o l o g y J C e l lP h y s i 0 1 2 0 0 4 ，2 8 6 ( 3 ) ：5 2 9 - 5 3 7 2 5 参考文献 【2 1 】A l t u n t a sA ，Y i l m a zM D E x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no fa q u a p o r i n - 1i nn a s a lp o l y p s ：D o e si t h a v ea n ys i g n i f i c a n c ei ne d e m af o r m a t i o n ? J A m e r i c a nJ o u r n a lo fR h i n o l o g y 2 0 0 6 ，2 0 ( 1 ) ： 1 2 8 - 1 3 1 【2 2 】M u l l e rC ，S e n d l e rM ，H i l d e b r a n d tJ ED o w n r e g u l a t i o no fa q u a p o r i n s1a n d5i nn a s a lg l a n d b yo s m o t i cs t r e s si nd u c k l i n g s A n a sp l a t y r h y n c h o s ：i m p l i c a t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no fh y p e r t o n i c f l u i d J J o u r n a lo fE x p e r i m e n t a lB i o l o g y 2 0 0 6 ，2 0 9 ( 2 0 ) ：4 0 6 7 - - 4 0 7 6 【2 3 】M a t s u z a k iT ，S u z u k iLe ta 1 W a t e rc h a n n e lp r o t e i nA Q P - 3 i sp r e s e n ti ne p i t h e l i ae x p o s e dt o t h ee n v i r o n m e n to fp o s s i b l ew a t e rl o s s J H i s t o c h e mC y t o c h e m 1 9 9 9 , 4 7 ( 1 0 ) ：1 2 7 5 - 1 2 8 6 【2 4 】J u nE S ，J u n gJ S C h a n g e si ne x p r e s s i o no fi o nc h a n n e l sa n da q u a p o r i n sm R N Ad u r i n g d i f f e r e n t i a t i o ni nn o r m a lh u m a nn a s a le p i t h e l i a lc e l l s J L i f eS c i e n c e 2 0 0 1 ，6 8 ( 7 ) ：8 2 7 8 4 0 2 5 lA b l i m i tA ，M a t s u z a k i 瓦e ta 1 I m m u n o l o c a l i z a t i o no fw a t e rc h a n n e la q u a p o r i n si nt h en a s a l o l f a c t o r ym u c o s a J A r c h i v e so fH i s t o l o g ya n dC y t o l o g y 2 0 0 6 ，6 9 ( 1 ) ：1 - 1 2 【2 6 】T a n c h a r o e n ，M a t s u y a m a ，e ta 1 T h er o l eo f w a t e rc h a n n e la q u a p o r i n3i nt h em e c h a n i s mo f T N F - a l p h a - m e d i a t e dp r o i n f l a m m a t o r ye v e n t S ：I m p l i c a t i o ni np e r i o d o n t a li n f l a m m a t i o n ，J o u r n a lo f c e l l u l a rp h y s i o l o g y 【J 】2 0 0 8 ，2 1 7 ( 2 ) ：3 3 8 3 4 9 【2 7 】H a r a - C h i k u m aM R o l e so fa q u a p o r i n 0 3i nt h ee p i d e r m i s ，J o u r n a lo fi n v e s t i g a t i v e d e r m a t o l o g y 【J 】2 0 0 8 ，1 2 8 ( 9 ) ：2 1 4 5 2 1 5 1 【2 8 】B a u mB r u c e A q u a p o r i n 一1g e n et r a n s f e rt oc o r r e c tr a d i a t i o n i n d u c e ds a l i v a r yh y p o f u n c t i o n ， H a n d bE x pP h a r m a c o l 【J 1 2 0 0 9 ，19 0 ：4 0 3 - 1 8 【2 9 】张勋，袁永一等水通