应用自体和同种异体半腱肌重建兔前叉韧带后移植物组织学转归对比研究.doc

河北医科大学硕士学位论文应用自体和同种异体半腱肌重建兔前叉韧带后移植物组织学转归对比研究姓名：郝建学申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：高石军20090301中文摘要动物分组与取材只骨骼成熟雄性新西兰兔随机分为两组，分别接受自体半腱肌和同种异体半腱肌重建，异体半腱肌的取材与保存是无菌操作下取同种异体的成年雄性新西兰兔半腱肌，手术取髌腱内侧纵行切口，于胫骨结节内后，大腿内侧，分离出半腱肌腱，修整干净后每根分别以三层无菌密封袋封装，将标本置入冰箱内保存天后备用。手术方法每只新西兰兔予氨基甲酸乙酯（乌拉士）耳缘静脉注射及氯胺酮肌肉注射行全身麻醉，术前肌肉注射青霉素万单位预防感染。双膝术区备皮，消毒，铺无菌手术巾。屈膝度，取髌腱内侧纵行切口，予胫骨结节内后，大腿内侧，分离出半腱肌腱，保留远端止点，向上自腱和肌腹交界处以上尽量靠近近端切断，以保留尽量长的半腱肌腱，剔除肌性部分，腱近端用的涤纶编织线缝编做为牵引线备用。沿髌腱内侧切开至关节腔，外推髌骨致脱位，切断翼状皱襞，于上下止点处完整切除，查前抽屉及试验阳性，然后用钻头自胫骨结节内上骨面向原下止点钻骨道，通过该骨道再向上、向外、向后至股骨外髁髁间侧面，靠近上止点处钻骨道，钻通至股骨外髁外侧的骨面，用钢丝引导牵引线，将肌腱自内侧副韧带的浅层，穿经胫骨和股骨骨道，于屈膝位拉紧，用克氏针分别于股骨胫骨干上钻孔，以骨桥法将肌腱牢固固定于股骨、胫骨外侧的骨面上。查前抽屉及试验阴性后，庆大霉素盐水冲洗关节腔和皮下，逐层间断缝合切口。术后肌注青霉素次（万单位次天）。术后统一笼养，自由活中文摘要动。组织学观察分别于术后周、周、周、周随机取材，每次取只，肉眼观察关节腔内重建韧带的大体形态，、甲苯胺兰及免疫组织化学染色，观察关节腔内重建韧带的组织学变化过程及血管生成情况，并用管计数法对血管生成数量进行定量检测。结果：解剖及组织学方面：兔交叉韧带在大体解剖形态上与人类基本相同，重建后韧带在关节内经历了再血管化、细胞长入、胶原纤维再生和再塑型的过程。组织学染色显示术后周时，组织内部呈坏死状态，周边成纤维细胞样细胞开始长入，以炎性细胞为主。甲苯胺蓝染色无异染物质出现。免疫组化血管阳性染色位于移植物韧带束膜，自体移植物组和异体移植物组无明显差别。术后周自体移植物组进入供体的血管（）多于同种异体移植物组（），自体移植物组成纤维细胞样细胞数目多于异体移植物组，两组甲苯胺蓝染色无异染物质出现。术后周大量成纤维细胞样细胞进入移植物，自体移植物组成纤维细胞样细胞数目多于异体移植物组，自体移植物组甲苯胺蓝异染物质开始出现，两组的免疫组化血管阳性染色均增加，但异体移植物组（）仍然少于自体移植物组（）。术后周，自体移植物组（分别为）血管计数均低于异体移植物组（分别为），但仍比正常（）数目多，成纤维细胞样细胞呈较统一的梭形，周围区细胞核主要为纺锤体状、杆状，中心区圆形、椭圆形细胞核稍多，可见串珠样排列，核周围有陷窝，中文摘要类似于软骨细胞；胶原纤维纵向排列规律有序，并呈波状，其组织学形态已经类似正常。异体移植物组细胞数目比自体移植物组多，胶原纤维束沿应力方向排列、较规律。两组甲苯胺兰染色均可以见到异染。异体移植物组血管阳性染色较周时减少，但多于自体移植物组，自体移植物组阳性染色较前减少。组织学和组织化学变化过程说明异体移植物组塑性改建过程滞后于自体移植物组。结论：本课题采用自体和异体双股半腱肌腱重建兔，通过两种不同移植物重建的组织学和免疫组织化学表现，探讨了这两种不同移植物重建对移植物新生血管的生成情况。实验结果显示：正常在组织形态学、组织化学和胶原分布上均表现出其特异性，与一般的肌腱和韧带组织不同，具有类软骨特性。关节腔内用来重建的自体和异体半腱肌腱移植物均经历了缺血坏死炎症期、再血管化过程、成纤维细胞增殖和植入期以及韧带的塑型改造期。同种异体半腱肌的塑性改建过程滞后于自体半腱肌，提示临床上重建术后应考虑以植物的选择对康复的影响，康复程序应根据移植物类型的不同而制定不同的时间。关键词：兔；前交叉韧带；重建；自体移植物；同种异体移植物；半腱肌英文摘要：（），（），（）丐英文摘要粥刍，一。（），英文摘要：，衄（）（），（），英文摘要一（），（）（），（），。，：英文摘要，：；河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名多髟户之芗导师签章：河北医科大学研究生学位论文独创性声明。、一、。二一：。，。、乏：、学院领导耸；形叠秘莎永本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生繇多膨翩擗匆驴年夤歹、日研究论文应用自体和同种异体半腱肌重建兔前叉韧带后移植物组织学转归对比研究吐！叁一刖吾前交叉韧带（，）是稳定膝关节的重要结构，断裂是骨科常见损伤【。，国外报道在岁人群中发病率为。损伤后可产生明显的膝关节前向不稳并导致一系列继发性损害，可继发关节软骨、半月板等结构损坏和骨性关节炎的发生，影响功能，严重者可导致膝关节病废。损伤多见于交通事故及足球、摔跤、柔道、篮球、体操等项目，最近年，随着我国体育运动的深入发展以及现代交通工业的迅速发展，损伤发病率不断提高，关于的研究日趋增多。断裂后不能自发愈合，世纪年代之前对前交叉韧带损伤多采用石膏管型固定的非手术治疗，但疗效差，术后关节僵直及韧带不愈合并发症很多。和采用手术缝合修复断裂的韧带，但其治疗效果与非手术治疗相当。等【】报道了组开放手术，采用异体移植物重建的结果，认为异体移植物重建可以最大程度地缓解疼痛、恢复膝关节功能。等回顾性比较叉韧带缝合修复，重建术式治疗交叉韧带损伤，结果表明重建的治疗效果好。近年来，随着关节镜技术的快速发展，关节镜下重建术为更多的学者所推崇，尽管近年仍有开放手术重建的报道，但关节镜辅助和完全关节镜下重建日益成为主流的治疗方法【】。目前断裂后的治疗方研究论文法是关节镜下韧带重建术，重建术已成为骨科与运动医学领域内最成功的技术之一【。重建的移植物有多种选择，目前临床上重建韧带所采用的移植物主要分为自体组织，异体组织和人工韧带组织，自体移植物最常用的是胭绳肌腱，股四头肌腱和髂胫束和骨一髌腱一骨（）。常用的同种异体移植物有、跟腱、胭绳肌腱、胫前肌腱和胫后肌腱等。人工韧带主要分为永久型、加强型和支架型三种。等人【】证明移植物是影响重建效果主要的因素之一。前交叉韧带的自体移植【重建目前临床应用最多，疗效较为可靠，但这类手术有其不足之处：操作复杂、破坏供区的正常生理结构，并且术中常因供区有限及供区肌腱自身条件限制不能取得足够大小的移植物而导致术后疗效欠佳，对于一些自体移植重建失败及一些多发损伤的病例，自体移植重建则取材受到限制。人工材料韧带由于其转归的问题和组织相容性问题在使用上受到限制。同种异体移植物的主要缺点是疾病传播和免疫排斥反应，但随着消毒方法和保存技术的进展，这些缺陷可以克服。异体移植物的主要优点有：无供区并发症，手术时间短，创伤小，瘢痕小；移植物数量及大小不受限，很适合于重建后翻修术和多发性韧带损伤。同种异体组织移植物的发展成为人们关注的一个热点。等【】资料显示，近几年选用同种异体移植物作为一期修复和返修手术增加了约。充分理解自体和同种异体移植物重建在生物力学和生物性质上的区别是十分有必要的，但目前关于这一问题的临床以及基础研究没有确切的理论依据。大部分临床研究研究论文发现应用自体或异体移植物重建对临床结果没有显著型区别【每，最近有研究报道用同种异体移植物重建长期愈合中增加膝关节松弛【，并且重建】后断裂发生率增加。一些基础研究支持这一临床结果，发现同种异体移植物重建生物力学性质差并且移植物塑性改建推迟，但有些基础研究发现自体和异体移植物重建没有差别【。因此本研究通过兔自体和同种异体半腱肌重建，探讨移植物重塑过程中的组织学改变及血循环重建情况，以期为临床重建前交叉韧带选材提供实验依据。研究论文材料与方法主要仪器及设备显微镜：，编号：，日本显微摄像设备：，编号：，日本电热恒温培养箱：型，编号：，上海市实验仪器总厂轮转式石蜡切片机：型，编号：，小型三用水箱：，编号：，北京市长风仪器仪表公司精密计：型，编号：，上海电磁仪器广三速低压骨钻：型，编号：，天津医疗器械厂点对点定位导向仪：自制（见）低温冰箱：型，编号：，日本低速离心机：型，编号：，北京京立离心机有限公司超净工作台：，编号：北京五洲东方科技有限发展公司高压消毒锅：，编号：，上海三申医疗器械有限公司材料和试剂苯蜡：液体石蜡与二甲苯以的比例混合。研究论文苏木素：苏木素克，无水乙醇毫升，钾明矾克，蒸馏水毫升，氧化汞克，冰醋酸毫升。水溶性伊红乙醇液：伊红克，蒸馏水毫升，乙醇毫升，冰醋酸滴。甲苯胺蓝乙醇液：甲苯胺蓝克，乙醇毫升。盐酸乙醇分化液：盐酸毫升，乙醇毫升。中性缓冲福尔马林：甲醛毫升，蒸馏水毫升，克，克，。鼠抗人单克隆抗体（公司）。链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒（试剂盒，福州迈新公司），其中包括过氧化物酶阻断剂（液），正常非免疫动物血清（液），生物素标记羊抗鼠免疫球蛋白抗体（液）和过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白（液）。胃蛋白酶溶液（北京中山生物技术公司）。，二氨基联苯胺（）显色试剂盒（北京中山生物技术公司）。水溶性封片剂（武汉博士德生物工程有限公司）。多聚赖氨酸粘片剂（武汉博士德生物工程有限公司）。缓冲液：，加蒸馏水至，。实验方法同种异体半腱肌的取材与保存研究论文无菌操作下取同种异体的成年雄性新西兰兔半腱肌，手术取髌腱内侧纵行切口，于胫骨结节内后，大腿内侧，分离出半腱肌腱，修整干净后每根分别以三层无菌密封袋封装，标本置入冰箱内保存天后备用。实验动物及分组采用成年健康新西兰大白兔只，体重，平均，随机分为两组，每组只，一组行自体半腱肌键重建，另一组行同种异体半腱肌腱重建手术。每组分别于术后周、周、周、周取材，每次随机取只行组织学观察。手术方法每只新西兰兔予氨基甲酸乙酯（乌拉坦）耳缘静脉注射及氯胺酮，陵注射行全身麻醉，术前肌肉注射青霉素万单位预防感染。双膝术区备皮，消毒，铺无菌手术巾。屈膝度，取髌腱内侧纵行切口，于胫骨结节内后，大腿内侧，分离出半腱肌腱（），保留远端止点，向上自腱和肌腹交界处以上尽量靠近近端切断，以保留尽量长的半腱肌腱，剔除肌性部分（），腱近端用个的涤纶编织线缝编做为牵引线备用。沿髌腱内侧切开至关节腔，外推髌骨致脱位，切断翼状皱襞，于上下止点处完整切除，查前抽屉及试验阳性，然后用钻头白胫骨结节内上骨面向原下止点钻骨道（），通过该骨道再向上、向外、向后至股骨外髁髁间侧面，靠近上止点处钻骨道，钻通至股骨外髁外侧的骨面（）；用钢丝引导牵引线，将肌腱自内侧副韧带的浅层，穿经胫骨和股骨骨隧道，于屈膝位拉紧，用克氏针分别于股骨胫骨干研究论文上钻孔，以骨桥法将肌腱牢固固定于股骨、胫骨外侧的骨面上（）。查前抽屉及试验阴性后，庆大霉素盐水冲洗关节腔和皮下，逐层间断缝合切口。术后肌注青霉素次（万单位次天）。术后统一笼养，自由活动。（手术示意图）标本取材取材前观察试验动物有无关节肿胀、跛行及其他异常；行膝关节前抽屉试验；切开关节囊后观察有无关节积液、滑膜炎表现及膝关节腔内重建韧带的大体形态，包括颜色，形状，光泽。每组分别于术后周、周、周、周取材，膝关节剔除关节囊外组织，打开关节囊，观察并记录关节内情况，生理盐水冲洗关节标本。取动物的双膝关节，固定于中性缓冲福尔马林溶液中待组织学和组织化学研究。制作石蜡标本关节腔内重建韧带固定于中性缓冲福尔马林溶液小时。上下骨道标本先固定于中性缓冲福尔马林溶液小时后，然后用甲酸脱钙液在室温下脱钙周，关节腔内重建韧带固定于中性缓冲福尔马林溶液小时。给与脱水、透明、浸蜡、包埋切片、烤片展片及捞片等制作。苏木素一伊红染色（染色）染色方法为脱蜡至水染色脱水、透明、封片。甲苯胺兰染色染色方法为脱蜡至水染色脱水、透明、封片。免疫组织化学分析血管生成管计数法对血管生成数量定量检测用血管计数法分析免疫组化染色结果【，阳性研究论文染色表现为点状棕褐色着色，定位于内皮细胞胞质，任何从邻近毛细血管分离出来的免疫组化染色阳性的内皮细胞簇均计数为血管。先用低倍镜（）扫描免疫组化染色切片，选定个血管数目最多的视野，再用个点的目镜来进行区域划分和定位，然后在高倍镜（）下按一定顺序开始对微血管最密集区域的个视野（）毒数，共得个数据，取其平均值，重复上述计数法，再取均数，即为每个标本的血管密度。统计学处理采用统计软件进行分析，实验数据以均值标准误（）表示，两组间均数采用检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，计算总体差异及进行两两比较。研究论文结果解剖学及组织学研究结果：兔正常解剖学特点：观察新西兰兔股骨止点止点形态为椭圆形，位于股骨外髁内侧面后部，止点位置及形态与人类基本相同。上端部分最细，向下逐渐增粗，呈扇形止于胫骨，韧带纤维在走行过程中形成外螺旋式结构，可分为前内束和后外束，其间无明显界限，前内束较大，在韧带的外面有滑膜包绕。胫骨止点位于内侧髁间棘的外前方，较股骨止点范围明显增大，呈扇形向前延伸，前方依次为外侧半月板前止点、内侧半月板前止点和胫骨结节。兔正常的组织学和组织化学研究结果：染色：组织学上为致密胶原结缔组织。纵切面观察胶原纤维基本呈复杂的三维排列，细胞位于胶原纤维之间，细胞形态主要有三种：梭形、椭圆形和圆形，后两种形态的细胞更倾向于成串珠状排列，有的周围有陷窝。（见）甲苯胺兰染色：在纤维束间及细胞周围均有异染现象，尤其在成串状排列的椭圆形或圆形细胞周围，而梭形细胞周围异染不明显。（见）免疫组化染色：血管标志阳性染色很少见，位于束膜。（）兔正常半腱肌的组织学和组织化学研究结果：染色：腱纤维束呈纵行波状排列，细胞较均匀的排列在纤维束之间，呈细长梭形（见）甲苯胺兰染色：腱纤维束间及腱细胞周围未见异染现象。研究论文（见）免疫组化染色：血管标志阳性染色位于束膜。（）试验动物标本肉眼大体形态观察：各组试验动物在取材前均运动良好，可以奔跑，未见关节肿胀、跛行及其他异常，查体见试验组膝关节前抽屉试验均为阴性，取材时关节腔内未见关节明显积液、滑膜炎表现，两组重建后均可见滑膜包绕，无明显差别，均近似柱状，颜色及光泽明显低于正常，术后周两组重建韧带的颜色及光泽与正常接近。试验动物标本组织学和组织化学染色结果：眦、甲苯胺兰组织学染色：术后周：两组移植物内部细胞消失，呈坏死状态，移植物表面有滑膜覆盖，边缘已经有细胞开始向中心长入，两组甲苯胺兰染色无异染，两组组织学染色表现无明显差别。（，）术后周：移植物表面滑膜增生明显，滑膜覆盖的部分可见梭形细胞由边缘向内部长入，自体移植物组梭形细胞的浸润明显高于异体移植物组，两组甲苯胺兰染色均无异染发生。（，）术后周：两组大部分移植物内部组织已经完全被新长入的细胞替代，自体移植物组细胞浸润高于异体移植物组，细胞排列方向也较异体组规则，与韧带长轴方向一致，细胞核呈长梭形为主，甲苯胺兰染色有异染现行的发生。异体移植物组细胞排列杂乱，细胞核以圆形为主，移植物中心部分偶可见到坏死区，甲苯胺兰染色无异染。研究论文（，）术后周：自体移植物组细胞较周时减少，但仍比正常数目多，细胞呈较统一的梭形，周围区细胞核主要为纺锤体状、杆状，中心区圆形、椭圆形细胞核稍多，可见串珠样排列，核周围有陷窝，类似于软骨细胞；胶原纤维纵向排列规律有序，并呈波状，其组织学形态已经类似正常。异体移植物组细胞数目比自体移植物组多，胶原纤维束沿应力方向排列、较规律。两组甲苯胺兰染色均可以见到异染。（，）免疫组织化学染色：术后周：两组均在移植物表明的细胞浸润区有轻度的阳性染色，两组无明显区别。（，）术后周：自体移植物组阳性染色明显多于异体移植物组，说明新生血管增加较多，新生血管的增加伴随细胞浸润的发生。（，）术后周：自体移植物组阳性染色仍然明显多于异体移植物组。但异体移植物阳性染色与自身想比较周时明显增加。（，）术后周：异体移植物组阳性染色较周时减少，但多于自体移植物组，自体移植物组阳性染色较前减少。（，）血管计数正常为，术后周，自体移植物组（）和异体移植物组（）血管计数无统计学意义；术后周和周，自体移植物组（分别为和。）血管计数均高于异体移植物组（分研究论文别为和），有显著差异，具有统计学意义；术后周，自体移植物组（分别为）血管计数均低于异体移植物组（分别为），有显著差异，具有统计学意义。（）研究论文附图研究论文同熏蔫矿？：翻：越：舳：就鼢研究论文峄一，二一一：二一，薯黪？。，一：一二！。二冬一。一一，毫囊每（）：。：。：）一溺研究论文要寰辫二；。”墨釜。一、。亨，、一癣睡茹每鳝薅妻譬薏一妻一：二、：、一？（）：。：。（）研究论文互。：一（）：）研究论文鬻砭零纛露萋割霉憨麓瓣，一。，一。一，一一一，了：甙）：（曲戤熬黧研究论文一霉攀戮。一二霎攀。軎”罗，二。一（）：（）研究论文藿冀妻睦羹麦篓霎爹，（）：（）研究论文（）如坞一组组一一物物一一植植一一蚯移移一常体体一一自壁日口阿；研究论文讨论是膝关节内的强大韧带，断裂是骨科常见的损伤，其断裂后所带来的原发关节不稳及继发的关节损害已被公认，作为关节内韧带与侧副韧带等关节外韧带在结构构成，细胞构成以及对损伤的反应等方面有很大的不同【，这是造成断裂后不能自发愈合的主要原因，因此通过重建才能可靠的恢复关节的稳定性。近二十年来，重建已经成为一种被普遍应用的手术【】，并且在临床上起到了较为成功改善关节功能的作用。目前关于重建术的手术指征、手术技术等方面已经基本形成了共测矧，但是关于应用何种替代物重建，采用何种方式重建，移植物在体内何时变为成熟的韧带足以承受正常的生理应力仍有争议，而理论上只有韧带在骨道及关节内达到完全成熟的韧带化后才能允许患者进行完全强度的运动。因此，这也是目前康复程序仍无一个公认标准的原因剐。最近几年，同种异体移植物的应用呈现逐渐上升的趋势。目前组织库可以提供各种形式的同种异体移植物，如骨一髌腱一骨、跟腱、半腱肌、胫前肌腱和股四头肌腱等，除骨一髌腱一骨外，目前关于自体和同种异体移植物重建的生物学愈合作用的比较文献报道很少，。大部分同种异体移植物重建的动物实验只是单纯的评价异体移植物的愈合作用，没有对照和与其他的自体移植物重建的愈合作用作比较【】。很少的几个研究比较了自体移植物和同种异体移植物重建的区别瞄，并且研究结果存在不同的分歧，有人认为没有区别，有人认为自体移植研究论文物重建的愈合过程快于同种异体移植物。本研究中，我们采用新西兰兔作为实验动物，比较了采用自体和同种异体双股半腱肌腱重建的组织学表现并用免疫组织化学观察新生血管的生成情况。在组织学结构不同于其它的韧带和肌腱。它位于关节腔内，但包被滑膜，因此实际是一个关节腔外的组织，带有自身螺旋，从组织学形态上看，其胶原纤维呈复杂的三雏走向，细胞形态则兼具致密结缔组织细胞和纤维软骨细胞的特征。致密结缔组织细胞在纵切面上应为梭形，纤维软骨细胞则应为椭圆形或圆形，带有陷窝，多成串排列。本研究在兔正常胶原纤维的纵切面上均可以同时观察到这几种形态的细胞，还有的细胞为椭圆形或圆形无陷窝的细胞（），其中椭圆形和圆形细胞更倾向成串排列，甲苯胺兰染色时细胞周围基质异染（），说明这些细胞合成部分酸性粘多糖蛋白，而酸性粘多糖蛋白是软骨细胞的特征之一。因此虽然正常在组织学上被划分为致密结缔组织，但它含有类软骨细胞，这些细胞呈椭圆形或圆形，成串排列，甲苯胺兰染色细胞周围基质有异染。而在兔正常半腱肌中，腱纤维束呈纵行波状排列，细胞较均匀的排列在纤维束之间，呈细长梭形（），腱纤维束间及腱细胞周围未见异染现象饵），因此，我们可以把正常具有类软骨特性作为评价重建塑形改建成熟度的重要依据。理论上讲，致密结缔组织如肌腱或韧带比较多地承受牵张力，具有特别强的抗张作用，而纤维软骨则兼具抗张和缓冲压力的作用，但抗张强度不如致密结缔组织。因此不仅是一个稳定膝关节的组织，而且应该在一定程度上能够缓冲外力。正常研究论文兔和半腱肌肌腱的血管染色均位于束膜，半腱肌肌腱的血管多于（，）。韧带重建术，不管用什么移植材料只是起到框架作用，韧带移植物形成强有