原料奶中嗜冷菌的快速检测.doc

浙江大学生物系统工程与食品科学学院硕士学位论文原料奶中嗜冷菌的快速检测姓名：吕元申请学位级别：硕士专业：食品安全指导教师：叶兴乾20100101浙江大学硕士学位论文，曲，：，浙江大学硕上学位论文，诵，：，浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日浙江大学硕士学位论文致谢时光飞逝，两年半的研究生学习生活即将结束。在硕士学位攻读期间收获颇多，不仅仅是论文和成果，更是人生的一种经历。华家池畔生活的点点滴滴已化作珍贵的回忆。期间最令我难忘的是导师叶兴乾教授在学业上和生活上所给予我的指导、关怀和照顾，叶老师渊博的学识、严谨的态度和待人谦和的品格都给我留下了深刻的印象。学术上，叶老师很强调自主性、动手性，而这些正是当初刚进入研究生阶段的我所欠缺的。通过叶老师对我的悉心指导和言传身教，我逐渐学会了如何做研究，更学会了一种面对工作积极主动的态度，这些都让我受益匪浅；生活上，叶老师的点滴关怀更让我体会到了长辈的慈爱。在此谨向叶老师表示衷心的感谢和崇高的敬意！感谢本实验组刘东红老师、陈健初老师、苏平老师、吴丹老师在我硕士学习过程中所给予我的关心和指导！感谢师兄刘振峰、张进杰、孟瑞峰、张宇环、但俊峰、黄伟、翟金亮，师姐马亚琴、吕飞、孙玉敬、魏云霄、杨海花、江萍的关心和指导，在我实验遇到困难的时候，师兄师姐们都会热心地提供帮助，帮我分析原因，查找解决方法，克服种种困难，顺利完成实验。感谢师弟师妹们的支持和帮助，从他们身上我也学到了很多。感谢同窗好友盛雪飞、王根女、刘芬、李俊、朱潘炜平日里的关心、帮助和鼓励，与你们在一起的两年半同窗时光是我人生中难忘的一段经历。感谢远在荷兰瓦赫宁根的好友郑皓恬，在论文下载方面给与我很大的帮助。最后，感谢我的父母及家人为我的成长所倾注的心血和无私的爱，使我在遇到困难与挫折时能够坚定信心、勇敢面对，在人生的道路上不断前进。吕元二零一零年一月于华家池浙江大学硕士学位论文第一章绪论嗜冷菌的定义第一章绪论嗜冷菌这一概念最初是在年研究人员首次发现在条件下生长的微生物时提出来的。自此，微生物学术界描述嗜冷菌的名词多达几十种。在年定义最适生长温度等于或低于，最高生长温度不高于的微生物总称为嗜冷菌（，）。但随着越来越多的低温微生物的发现，科研人员发现的定义并不精确，因为一些嗜冷菌不但可在条件下生长，还可以在以上的温度条件下正常生长（韩晓云等，）；一些嗜温菌也可以在低于的温度下正常生长（，），显然的定义并不完善。在定义的基础上，将嗜冷菌进行细分，定义那些只能生活在低温下且最高生长温度不超过，最适生长温度等于或小于，在及以下都可以繁殖生长的嗜冷菌为专性嗜冷菌（）；将最高生长温度可以超过，在。的环境中可以生长，一般生长温度范围在的嗜冷菌定义为兼性嗜冷菌（）（）。此外，还有很多人提出专性嗜冷菌和兼性嗜冷菌的概念，各个定义之间差异不大。目前食品微生物领域广泛接受嗜冷菌的概念是：。下能够生长并在天内产生可见茵落的微生物。嗜冷菌的分布及种类在地球的生态系统中存在着广泛的低温环境。大部分的海洋两极地区、常年积雪的高山、冰川、和高山湖泊、部分温带湖泊湖底静水层等为永久性低温地区；温带土壤、部分海洋和湖泊表层、洞穴等地区温度随季节变化，为非永久性低温地区。由于嗜冷菌对温度很敏感，因此嗜冷菌的分布很受环境的限制（唐兵，）。从稳定低温环境（深海和冰洞）分离的嗜冷菌通常为专性嗜冷菌。相比之下，在不稳定低温环境难以分离专性嗜冷菌，比较容易分离出兼性嗜冷菌。这些兼性嗜冷菌的生长温度范围较宽，在极端环境条件下有较强的生存能力。除上述自然低温环境外，在许多人造低温环境，如冷库、冰箱等地方也生存着嗜冷菌，这些嗜冷菌与人类的日常生活和健康密切相关。人们首次分离出有生浙江大学硕士学位论文第一章绪论命的嗜冷微生物就是从冷冻的鱼体内。自此以后，科学家们先后从土壤、海洋，食品等低温环境中分离出嗜冷微生物。在这些不稳定的低温环境中，很难分离到专性嗜冷菌。嗜冷菌种类繁多，广泛分布在各种低温环境中，有自养菌也有异养菌，有好氧菌也有厌氧菌（唐兵，）。在已分离出的嗜冷菌中，细菌是最多的一类，有多个属，且绝大多数为革兰氏阴性菌。已鉴出来的嗜冷菌有假单胞菌、弧菌、无色杆菌、黄杆菌、嗜纤维菌和螺菌等。和用数值分类法对南极海洋沉积物中分离的株嗜冷菌进行研究，得出为弧菌，为产碱杆菌，为假单胞菌和为黄杆菌。其他不能用伯杰手册第八版的方法鉴定。革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌出现的频率小得多，厌氧菌也少（，）。等人对株来自南极的细菌进行了分析，其中大部分是异养和需氧革兰氏阴性杆菌或球菌，只有株为革兰氏阳性菌。这些细菌中有株菌可分泌脂酶、蛋白水解酶。菌株一般在之间生长，左右死亡，时平均代谢值为小时。随着温度的升高，这些菌所分泌酶的活性呈下降趋势（，）。至今所分离的嗜冷菌中细菌比较常见的大致可分为以下几个种属（宋焕禄，）：假单胞菌属（）、肠道菌属（）、黄杆菌属（）、色杆菌属（）、产碱杆菌属（），微球菌属（）、链球禹（）和乳杆菌属（）等。除细菌外，人们在南极的土壤和湖泊中发现有放线菌、霉菌、酵母等嗜冷菌，还在冰雪、海冰中发现低温藻类（，）。例如将雪染成红色的嗜冷菌“雪藻”。这些“雪藻”在以上不能生长，为专性嗜冷菌。嗜冷菌适应低温的分子机制嗜冷微生物长期生活在低温的环境中，生物体内的温度与外部环境温度很接近。低温通过各种途径影响嗜冷菌的生命活动：降低细胞的生化反应速率、影响某些细胞组分的稳定性以及冷冻所造成的破裂作用。为了生存，这些微生物需要一系列的适应机制来将极端环境所造成的损害减少到最低程度。尽管低温对生化反应有着强烈的负效应，但嗜冷微生物可在低温下却能成功地生长与繁殖，这说明嗜冷微生物在长期生物进化过程中形成了一系列适应低温的机制，主要体现在浙江大学硕士学位论文第章绪论细胞膜、蛋白质、酶分子水平上发生的组成和结构的变化（林学政等，）。这些机制弥补了低温对嗜冷菌生长的有害影响。细胞膜低温会影响细胞膜的功能，并强烈地抑制胞内的生物化学反应过程，但嗜冷菌却能够从周围环境中吸收营养物质，正常地进行新陈代谢与生长繁殖。其原因是在低温条件下嗜冷菌能通过增加膜脂中不饱和脂肪酸、短链与支链脂肪酸的含量来降低膜脂的相变温度（辛明秀等，），这保证了膜在低温下的流动性。同时改变膜蛋白和脂多糖的磷酸化状态，这与低温菌感受外界环境温度变化的信号有关等。这些变化的结果共同、偿低温对微生物的有害效应，使其能适应低温环境。对嗜冷微生物细胞膜组成成分的研究表明，它们含有较高含量的不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸使细胞膜在低温下也能保持半流动状态。与中温微生物相比，嗜冷菌细胞膜中较多的直链和支链不饱和脂肪酸，降低了脂类的溶点，有助于其在低温条件下吸收环境中的营养物质，有利于微生物的生存（，）。某些嗜冷细菌的膜脂类组成中也含有多不饱和脂肪酸和含有多个双键的碳氢化合物。从几种生存于南极的细菌脂类组分中鉴别出了含有个双键的碳氢化合物（：）（杨文博，）。另外还有研究表明，兼性嗜冷菌在低温条件下可通过改变细胞外膜蛋白的结构，使通道孔径缩小，避免外界环境中某些毒素分子进入细胞。嗜冷菌还可在低温条件下大量分泌胞外脂肪酶、蛋白酶等，将环境中生物大分子降解成小分子，从而有利于营养物质通过细胞膜而保证微生物营养需求。嗜冷菌细胞膜能在低温下除了含有很多不饱和脂肪酸外，还能通过改变细胞膜的脂肪酸组成来保持细胞膜在低温时的流动性。最常见的反应是增加去饱和酶的活力，以增加不饱和脂肪酸的含量，降低脂双层中饱和脂肪酸对不饱和脂肪酸的比例。还有一种反应是缩短脂肪酸酰基链的长度、增加支链脂肪酸的比例或降低环状脂肪酸的比例，这对改善细胞膜的流动性具有相似的效果（，）。等人的研究证实了这一观点，作者对从南极分离的两种嗜冷菌（和）的膜脂组成的研究表明：当培养温度降低时，菌株浙江大学硕士学位论文第一章绪论如在丰富培养基培养，脂肪酸平均链长度缩短；在营养贫乏培养基培养时，直链脂肪酸、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸减少，支链脂肪酸增加。而菌株在低温条件下，无论在丰富还是在营养贫乏培养基中培养，都将导致脂肪酸不饱和指数的增；寿（，）。两种规律在比较中温酵母和嗜冷酵母同时处于低温时也可以清楚的发现。所有这些变化对于低温时维持膜的流动性具有重要意义，而膜的流动性为营养物质的转运和吸收提供了基础。细胞质细胞内酶反应需要合适的外部环境，当细胞处于寒冷的温度下，嗜冷细胞内的细胞质分子热运动大大降低。低温还会引起细胞外水环境的结冰将对细胞造成脱水和渗透压胁迫等损害，如没有其他化合物进一步降低其冰点，则可能严重影响酶的活力，甚至导致细胞质处于冰冻状态。认为，嗜冷菌启用一系列的适应机制减少在冷冻过程中对细胞造成的伤害一是产生某些胞外物质，防止或减少细胞周围冰晶核的形成，从而防止冷冻对细胞的损害。二是增加细胞内溶质的浓度，从而降低细胞质的冰点。此生理特征能减少冷冻时因维持渗透压平衡而造成的细胞失水量，从而减轻冷冻对细胞的损害（，）。吴虹等人在研究南极冰藻的低温适应性时发现，随着温度的降低，细胞内的脯氨酸含量迅速增加，细胞内可溶性糖的含量也随着温度的降低而增加（吴虹等，）。脯氨酸在冰藻低温生存的作用可能有以下几方面：首先脯氨酸是细胞内重要的渗透调节剂；其次脯氨酸可以保护细胞内的生物聚合体的结构，使之不受温度变化的影响；再次脯氨酸可与细胞内的一些化合物形成聚合物，具有降低细胞质冰点的作用；最后脯氨酸具有羟基自由基清除剂的作用，能够清除低温下产生的活性氧，保护细胞膜免受破坏。可见，只有各个细胞组分的协同作用才能使嗜冷茵适应低温的环境。细胞内的酶生物体内的新陈代谢过程几乎都是在酶的催化下进行的。由于低温会抑制酶浙江大学硕士学位论文第一章绪论的活性，故嗜冷菌细胞内的酶必须适应低温并保持高催化活性，才能满足其生命活动的需要。嗜冷菌在低温环境会产生的很多酶，这些酶在低温下才显示高效的催化效率，而在高温下很快失活，被称为嗜冷酶。嗜冷酶之所以在低温下显示较高的催化效率，首先是因为嗜冷酶的最适反应温度较低，一般比中温菌酶的最适反应温度低一，且在。范围内的催化活性比相应的中温酶高。如嗜冷性海洋微生物中分离的蛋白酶在时活性约为。时的，而从土壤中分离的蛋白酶在时活性仅为时的（邱秀宝等，）；其次，嗜冷酶在低温环境中的转换数（）和生理效率（）高于中温菌的同类酶，以此来弥补由于低温引起的生化反应速度降低的不利影响，使嗜冷菌保持正常的新陈代谢活动；最后嗜冷酶对底物亲和力强，分子的结构具有更大的柔性与可变性，由此保证低温时酶分子容易与底物结合，同时也降低了结合过程中酶的变构作用与催化底物变化所需的活化能，提高了对底物的利用率，故嗜冷酶在低温时需要较少的能量就可以完成催化过程（辛明秀等，）。这些都是嗜冷菌在自然环境中对低温环境做出的适应性。细胞内的蛋白质和蛋白质合成中温菌特别是高温菌中的蛋白质是冷不稳定的，随温度降低，活性也逐渐降低。嗜冷菌中的蛋白质在低温下能保持结构上的完整性和催化功能，分离出的酶蛋白在低温下也是稳定的且具有很高的催化活性。嗜冷菌中的蛋白质之所以能在低温下能保持活性，是由于其蛋白分子能形成相对松动和具有弹性的结构，如上面提到的嗜冷酶蛋白。通过对嗜冷酶的蛋白质模型和射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用。温度升高时，嗜冷酶中的弱键容易被破坏，使酶变性失活。例如：从南极海水分离的枯草杆菌蛋白酶与公司的嗜温枯草杆菌蛋白酶进行比较，南极海水分离的枯草杆菌蛋白酶的肽链稍长，酶分子中的盐键数量减少，芳香作用减低，对亲和力减少，与溶剂的相互作用增加，这些变化有利于增加酶的柔韧性，使其在低温下容易与底物结合，体现了典型的嗜冷酶的特性（林影等，）浙江大学硕士学位论文第一章绪论嗜冷菌中的蛋白质在低温下能保持活性，是由于嗜冷菌中的蛋白质是以单体或多聚物的形式存在的。如嗜冷菌的异柠檬酸脱氢酶，其单体形式比二聚体形式对热敏感。当温度超过。时，其单体即迅速失去活性，但当温度降至时又立刻恢复活性。低温微生物在它们的生长温度范围内有的细胞内蛋白质是通过积极的调节机制合成的（，）。嗜冷菌中的蛋白质在低温下能保持活性，是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，使嗜冷菌在时还具有合成蛋白质的能力。温度影响细胞中总蛋白质的合成是通过影响核糖体上蛋白质的翻译速率或是通过影响某种特异翻译的起始或翻译的速率实现的。体外实验表明，在同样低温条件下嗜冷菌体外蛋白质翻译的错误率最低。从耐冷菌的核糖体分离到一种蛋白质具有在翻译蛋白质的能力。这种蛋白质能使大肠杆菌的核糖体在翻译这种蛋白质，但在时就失去了活陛（，）。还有研究表明嗜冷菌在低温下合成蛋白质的能力是由于核糖体的亚基，但也有结果显示低温下蛋白质的合成能力与细胞中的可溶性因子有关（，）。由此可见嗜冷菌在适应低温的能力表现为翻译机制的适应性以及在低温下能保持完整的膜结构。冷休克蛋白当嗜冷菌所处的环境温度突然降低时，一些嗜冷菌细胞会诱导合成一组冷休克蛋白，它们在微生物低温生理适应过程中发挥着重要作用。冷休克蛋白首先是在大肠杆菌中被发现的。实验人员将大肠杆菌从突然转移到时，细胞会诱导合成一组冷休克蛋白（辛秀明等，）。当在低温下连续培养嗜冷菌，其细胞内可以合成各种冷休克蛋白，而且合成量随培养温度的降低而增加。对几种南极嗜冷菌的冷休克蛋白的研究表明，冷休克蛋白的基因在研究的绝大多数嗜冷菌中都存在。在培养和与在培养时相比，其基因的表达大量增加。也有研究结果表明，冷休克蛋白也可能起着抗冻蛋白的作用（唐兵，）。等人研究了嗜冷酵母的冷休克反应。当生长温度从降为，嗜冷酵母在小时内可诱导合成种冷休克蛋白，这些蛋浙江大学硕士学位论文第一章绪论白是对冷刺激的反应（，）。还有研究人员发现在。耐冷菌合成冷休克蛋白，而这些蛋白在较高温度时不被合成。这说明冷休克蛋白与低温环境是相联系的，但冷休克蛋白微生物适应低温的具体机制尚需进一步阐明（辛明秀等，）。等人认为冷休克蛋白的作用很可能是通过和相互作用来促进合成一些嗜冷菌在低温条件下生长所需的蛋白质（，）。冷休克蛋白的产生显然是嗜冷菌适应环境温度变化较大的自然低温环境的一种策略。还有研究表明嗜冷菌适应低温环境，还与转录后被修饰的程度有关。等人发现嗜冷菌转录后被修饰的程度较低，而这些修饰仅是维持的基本结构，同时嗜冷菌中二氢脲嘧啶含量高，这些都有助于局部构象有较好的柔性以及动力学上较好的流动性，这也是嗜冷菌对低温的一种适应（，）。综上所述嗜冷菌适应低温的能力是细胞内多重反应相互作用的结果。嗜冷菌对原料奶的危害乳与乳制品含有丰富的高质量蛋白、乳脂肪、糖类、维生素、矿物质、免疫活性因子等营养成分，被认为是“接近完善的食品”（张轶等，）。随着国家经济的发展和人民生活水平的提高，我国人民也开始注重对乳与乳制品的消费，尤其在城市更为突出，这一消费需求有力地推动了乳品行业的发展。自上世纪九十年代以来，我国乳业获得迅猛发展，引进了国外的先进技术、设备和经营管理经验，为牛奶总产量的提高和品种的增多提供了物质基础。原料奶产量的大幅增加及乳品产业的飞速发展必然使乳制品安全问题成为人们所关注的焦点之一。原料奶品质的优质与否，直接影响奶制品的质量，也影响奶制品的生产和消费。原料奶品质的关键在微生物指标上，健康的牛所分泌的原料奶是处于相对无菌状态，但原料奶从被挤出到运往乳品厂期间的每一环节都不可避免地受到微生物污染的威胁。研究表明，原料奶中的微生物主要有三个来源：（）来源于牛乳房内；（）来源于牛乳房和乳头表面；（）来源于挤奶和贮藏设备（王茂祥，）。而刚挤出的原料奶，温度在之间，加上它有丰富的营养和大量的水分，是微生物繁殖的良好培养基。若温度升高，将加速微生浙江大学硕士学位论文第一章绪论物的繁殖并导致原料奶的变酸腐败。因此，乳品厂会将原料奶冷却到。保存。原料奶在加工之前保持低温冷藏很大程度上抑制了微生物繁殖，但是嗜冷菌在此条件下仍可生长。随着乳品企业加工规模的不断扩大，原料奶从收集到加工可能需要存放一至数天。此时原料奶中嗜冷菌占主导地位，成为影响产品质量的主要因素。有研究表明新鲜原料奶冷藏天后，原料奶中的微生物主要是嗜冷菌，而且这些嗜冷菌主要是革兰氏阴性菌（杜晓明等，）。武若飞等人研究报道了在低温条件下，原料奶中嗜冷菌在冷藏的条件下繁殖期很短（最短的为小时），并会破坏牛乳成分，产生蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶（武若飞等，）。热杀菌处理可以破坏这些微生物，但在这些嗜冷菌生长过程中所产生的耐热胞外酶却可以仍然保持活性，即使经，秒的热处理，胞外脂肪酶的残留量约为，胞外蛋白酶的残留量约为（李忠，）。它们在奶制品贮藏的过程中将继续分解蛋白质和脂肪，从而导致产品发生变化，最终对成品乳制品产生不良影响：、蛋白酶分解乳蛋白将导致产品发苦，水解过程中释放的氨基酸会使褐变反应加剧；、蛋白酶分解酪蛋白会引起蛋白胶凝化；、脂肪酶分解脂肪球膜，将释放出自由脂肪酸，导致脂肪聚合上浮，产生一系列的风味缺陷，例如乳酪味、鱼味、麦芽味、腐烂味、肥皂味、不洁味或酵母味等等；、蛋白酶还会造成蛋白在片式热交换器内的淤塞，从而影响了生产持续时间，致使清洗困难；、嗜冷菌还会在设备表层和胶垫上形成生物膜（范江平等，）。此外，嗜冷菌还会产生色素、毒素以及粘性多糖等，造成乳及乳制品的变色、发粘等，这些都将严重影响乳制品的质量（，）。由于嗜冷菌产生的脂肪酶和蛋白酶对成品乳制品的质量有很大的影响，近年来研究人员着力研究出一种方法使这些酶失活。绝大多数嗜冷菌产生的酶均具有非常高的热稳定性，所以不能通过单一的加热处理来使这些酶失活。所以研究人员利用酶的低温失活现象，将巴氏消毒或灭菌结合低温加热处理，杀灭原料奶中嗜冷菌产生的热稳定性酶。最有效的方法是原料奶经处理后，随之在保温小时，此时原料奶中蛋白酶活性仅残余。但是，将大量的生奶或制成品在长时间保温无论是在设备或经济上都是行不通的。因此，乳品厂主要还是依靠控制原料奶中嗜冷菌的生长来控制其热稳定性酶的分泌，这就需要一种可以快速检测出原料奶中嗜冷茵数量的检测技术，可以为工厂实时提供浙江大学硕士学位论文第一章绪论原料奶中嗜冷菌数量的数据，比便乳品厂采取积极的措施（胥伯强，）。原料奶中嗜冷菌的检测方法对于牛奶中嗜冷菌的快速检测国外研究起步的较早，早在二十世纪六十代就已经注意到了原料乳中的嗜冷菌对乳品质的影响，并提出了多种解决措施。七八十年代，研究人员对嗜冷菌的研究较多，尝试了不同的检测方法。认为上世纪九十年代，对微生物快速、自动化检测的研究进入了蓬勃发展的阶段，那些基于微生物学、化学、生物化学，生物技术、免疫学技术、血清学技术的快速的、自动化的分析方法均可应用于对食品中的微生物的分离、前期检测、特性研究及计数上（，）。这其中大多数方法都适用于对奶制品的检测。国外学者探究出来的快速检测方法中，有的是在原有标准方法的基础上缩短了的检测时问，有的则是颠覆了以往传统的平板计数法，通过与时下新兴技术结合，开发出来的新的方法，结果证明这些方法都可以应用于对原料奶中嗜冷菌的检测，并且与传统方法相比大大缩短了检测时间，为这些方法在工业上的应用奠定了基础。我国乳品产业发展起步较晚，随着居民生活水平的提高，人们营养保健意识增强，国内牛奶消耗量大幅上升，原料奶受微生物污染问题日益突显出来，成为限制乳品工业发展的主要原因。当越来越多的原料奶被冷藏保存，嗜冷菌在低温下对原料奶的破坏作用也就成为一项影响奶品质的重要因素。由于我国对这一方面的研究开始的较晚，现在尚处于探索阶段，所以国内对于原料奶中嗜冷菌的研究和检测方法方面的报道还比较少。国外研究方法国外对嗜冷菌检测的标准方法很多，这些方法也在不断的改进，检测的时间也不断地缩短。以国际乳品联合会的检测标巨（标准）为例，阐述的嗜冷菌数的检测要求在条件下培养天计数（，）；中阐述的嗜冷菌数的检测是在条件下培养小时计数（，）。这些标准方法的检测时间很长，达不到工厂快速检测的要求。由此，在上个世纪八九十年代，国外研究者就不断的对嗜冷菌浙江大学硕士学位论文第一章绪论的检测方法进行研究和改进，以期得到一个即快速又准确，而且适合工业化应用的检测方法。虽然一些方法现在还未见在嗜冷菌检测上的报道，但检测原料奶中其他细菌的报道也为检测原料奶中的嗜冷菌提供了理论基础。、直接荧光过滤法（）方法是对样品中的活细胞进行计数的一种检测方法。样品经过滤后，其中的微生物就被留在过滤器里。用吖啶橙着染后置于紫外显微镜下进行观察。存活的细胞被染成橘红色，橘黄色或橘灰色，而死亡的细胞则被染成绿色的荧光。最后通过仪器对玻片上的细菌进行计数（，）。这个方法在对原料奶和其他食品中细菌的计数上得到了很好的应用。等人用此方法检测了八个奶制品实验室里保存的原料奶的卫生学质量，并将计数结果与菌落培养计数法得出的结果进行对比。结果表明，菌落培养计数的结果和方法测定的结果之间存在很好的线性关系（），这说明可以提供和那些菌落计数法相似的结果（，）。等人出于实践考虑，认为方法作为一种快速的检测方法相对于传统培养计数检测方法，是很好地一个改进（，）。和还将方法和荧光抗体结合用于测定牛奶和果汁中大肠杆菌：的数量（，）。方法的优点在于检测时间很短（小时），与传统上工业使用的平板计数法（天）相比，在时间上有很大优越性。如果在紫外显微镜下使用图象分析仪对细菌进行计数，一个操作人员可在很短的时间内对多份样品进行计数，检测数量大。方法的缺点在于，对于测定样品中含量很少的细菌，需要预先进行预培养以增加样品中目标微生物的数量，这样在检测时，结果的精确度才高。而这个预培养的时间一般是很长的（小时或更长），而且在实践中，样品中的细菌量要在舢，一时才会有很好的线性关系存在。再者这个方法需要仪器的是很昂贵的。这些都是这个方法在工业应用上需要解决的问题。、电阻抗方法（）电阻抗方法是通过测量微生物代谢引起的培养基电特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。微生物在培养过程中，随着微生物的生长，其生浙江大学硕士学位论文第一章绪论理代谢作用使培养基中的电惰性物质逐渐被培养基中电活性的分子和离子取代，使培养基导电性增强，电阻抗降低。研究表明电导率随时间的变化曲线与微生物生长曲线非常相似。当微生物的起始数量不同时，出现指数增长期的时间也不同，通过建立二者之间的关系，就能通过检测培养基电特性交化推算出微生物的原始菌量（周向华，）。在上世纪八十年代，电阻抗方法就已经被欧美国家用于牛奶、乳制品、肉和其他食品中细菌的检测上。起初、，等人分别使用电阻抗的方法测定原料奶中嗜冷菌的数量和细菌总数，但是测得的结果与标准平板计数方法之间的相关度都很低（，；，；，）。认为，这种相关性低的原因可能是培养基或是温度没有选择好（，）。和通过对培养基和培养温度的控制，优化了微生物的生长条件，在测定原料奶中细菌总数、嗜温菌数量和嗜冷菌数量时，得到了电阻抗测定结果和标准平板计数结果之间很高的相关系数（），将电阻抗方法在原料奶检测方面的应用步伐向前推进了一大步。在的实验中，我们可以看到当样品中嗜冷菌的数量达到以上时，测定时间为小时，而以往的平板计数法则需要天的时间（，）。和等人则是使用电阻抗的方法测定了四种乳制品（原料奶、巴氏消毒奶、奶油、冰激凌）中的大肠菌，并且将电阻抗方法和平板计数法进行比较。结果表明，在这四种乳制品中，这两种检测方法之间的相关度在卅。当电阻抗测定时间（）小于小时，表明样品中的大肠菌数量大于，如果大于小时，则说明样品中大肠菌的数量少于（，）。电阻抗法的优点在于检测时间比传统的标准平板计数法需要的时间要缩短很多，而且这个方法是利用仪器对样品进行测定，从而大大减少的人力的投入。从这一点来看，电阻抗方法在工业应用上比平板计数法具有优越性。这个方法的缺点在在于检测时间上，对于现代工业有大量待测原料奶样品的现状来说，小时的检测时间还是很长的，这一点限制了电阻抗法在工业上的推广利用。浙江大学硕士学位论文第一章绪论、法自从发明了聚合酶链式反应扩增技术（技术），科研人员开发了一系列基于技术来快速测定食品中致病微生物的新方法。这种检测方法操作简单、具有高灵敏度和高特异性，是快速检测食品微生物的一个重要方法。和等人在上个世纪九十年代将技术和技术结合用于测定冷藏牛奶中细菌的数量。他们找出一个片断，这段片断广泛地存在于冷藏原料乳的微生物中。实验结果证明，当人工接种细菌在时，检测方法中的样品的扩增吸光值（）效果最好，而且在测定下保存的原料奶中嗜冷菌的数量时，与传统的标准平板计数培养法之间存在很高的相关系数（，）（，）。等人用这个方法测定了原料奶中的大肠杆菌，检测范围在一（，）。和认为这种基于免疫学和基因技术的方法提供了一种互补的、创新的途径来检测食品中的微生物，不但减少了分析的时间，并且仍然可以保持高的可靠性和敏感度（，；，）。虽然技术比微生物纯培养的方法在检测食品中的目标微生物上要为更有效，但是当直接测定食品中的微生物时，它的敏感度会明显的下降，并且会出现假阳性的结果，因为这个方法要受到很多因素的限制。第一个挑战就是样品准备的过程时，从复杂的食品体系中提取所要扩增的。会受到存在于培养基、准备液和食品样品中的一些物质的抑制。这个抑制作用会使聚合酶变性、沉淀等（，）。从样品中转移走这些抑制反应的抑制物是十分困难的，这是影响实验的精确度的最主要问题（，）。除此以外，分析还存在很多缺点：使用大量的试管，数据处理比较困难以及需要使用价格昂贵的仪器等。另外一方面，等基因扩增技术虽然可以对微生物提供精确的检测，并且具有很高的灵敏度，但是需要从微生物中提取或，这个过程现在只可以在实验室条件下才能够得以实现，还未能用于工业生产中去，这也是制约这个技术在工业上应用的主要问题。、流动血细胞法（）流动血细胞法是一个具有潜在应用价值的微生物分析方法，它可以通过各种浙江大学硕士学位论文第一章绪论参数对目标微生物进行一个快速的分析，而且分析量很大。这个方法是将样品中所有的细菌都进行计数而不像标准平板计数法只对可以生长在培养基上的活细胞进行计数。因此，在检测牛奶的微生物质量方面，流动血细胞法所得的结果具有一定的代表性。等人是利用流动血细胞法测定了种丹麦散装牛奶样品，并且与传统的微生物分析方法标准平板计数法（标准）进行比较。实验结果表明，在对这种样品进行细菌计数，流动血细胞法与标准平板计数法之间的相关系数（）。在等人的研究中，流动血细胞计数法的细菌计数值要比标准平板计数法的计数值要高出倍，原因在于标准平板计数法是对活细胞进行计数，而流动血细胞法是对总体细胞进行计数，包括活细胞和死细胞，对死细胞的检测可以知道样品的原来质量的情况（，）。等人也利用这个方法测定牛奶中含量较少的腐败菌假单胞茵。实验总体时间为小时，其中培养时间为小时，检测时间为小时。结果表明，和标准的平板计数法相比，流动血细胞法具有很高的灵敏度。当样品中待测菌数量很少时，流动血细胞仍然可以检（，）。虽然流动血细胞法提供了快速，敏感，可靠的途径对食品中的目标微生物进行检测和计数，但是这个方法也存在一些缺点。一方面流动血细胞计数器价格很昂贵，而且实验操作也很复杂，对实验操作员的操作手法有很高的要求。另一方面，流动血细胞法的精度还要受到多种因素的影响，包括细菌种类、着色过程、浓缩过程、细菌的新陈代谢状况和检测过程中对细菌本身的伤害程度等。、酶联免疫吸附技术（）方法是基于酶反应的一种高特异性和高灵敏性的检测方法，它可以从复杂的样品体系中特异的与目标反应物结合，从而达到检出的目的。等人就是利用单克隆抗体和间接的方法测定了冷藏奶中的嗜冷菌，并且与嗜冷菌的平板计数法进行比较。实验结果表明，测定下保存的成品奶样品中嗜冷菌，平板计数法和方法之间存在非常好的相关系数（，），检测下限为嗜冷菌数量为（，）。方法的优点在于它的专一性很高，同时还可以得到和标准平板计数法相似的结果。但是这个方法仍然存在缺陷，有些时候由于样品中其他成分的干扰浙江大学硕士学位论文第一章绪论作用（牛奶中的酪蛋白和乳清蛋白会和目标微生物竞争与抗体结合等等），方法并不能检测出样品中的目标微生物，这一方面还有待于进一步的研究。、氨肽酶法由于革兰氏阴性嗜冷菌是冷藏原料奶中嗜冷菌主要的微生物类群（，）。氨肽酶法是利用革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁的氨肽酶活性进行检测的。大多数革兰氏阴性细菌细胞壁都具有这种酶，而且活性很高。在相同的条件下革兰氏阳性细菌却不能裂解底物或只表现出很弱的裂解活眭（，）。等人利用这个原理测定了冷藏原料奶的微生物学质量。他们用无色丙氨酸对硝基苯胺作为底物，通过嗜冷菌细胞壁的氨肽酶的作用使其裂解成硝基苯胺（黄色），最后用紫外分光光度计测定吸光值，间接反映样品中嗜冷菌的数量。实验结果表明氨肽酶法和传统的微生物计数方法之间存在很高的相关性（），所需的检测时间大约在小时，而且并不像其他特殊方法需要使用特别贵的仪器，并且实验操作也很简单（，）。这种利用氨基肽酶的活性来检测食品中的微生物的方法最早是应用于对冷藏猪肉中微生物的检测上，并且也取得了很好的结果。等人在上个世纪八十年代使用这种方法对冷藏猪肉中嗜冷菌进行了计数，检测时间为小时，与平板计数法之问的相关度为。在当时对嗜冷菌快速检测的方法中，这个方法是适合工业上应用的（，）。和等人也运用这个方法测定冷藏肉的微生物学质量。结果表明，结果与传统平板计数法结果之间的相关度很高（），检测时间和检测范围等人的研究结果是相似的。这也说明了这种方法在原料奶快速检测上理论上是同样可行（均（，甜，；，）。氨基肽酶法的优点在于可以在一个合理的时间内检测原料奶的质量。从成本方面上考虑这个方法成本很低，因为它所用到的仪器一般实验室都有。从实验操作方法上来看，此实验操作方法简单，不需要特殊的实验技术。这