亲和素桥连构建携抗P选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定.doc

南方医科大学硕士学位论文亲和素桥连构建携抗P-选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定姓名：郑道文申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：吴平生;宾建平20080415中文摘要效能的评价可采用多种体内和体外方法，近年来国外已有应用荧光显微镜和流式细胞术定性和定量评价特异性靶向超声微泡配体结合率的报道。体外荧光法具有直观显示靶向超声微泡构建过程的独特作用。因此，本研究拟利用生物素抗生蛋白链菌素（亲和素）生物素（）配体桥连技术构建一种可用于评价血管内皮炎症或再灌注损伤的携抗选择素单抗靶向超声微泡，并采用荧光显微镜和流式细胞术对其配体连接可靠性进行定性和定量观察。方法和结果一、普通脂质微泡（）的制备及荧光标记：称取一定比例的、等脂质材料及辅助材料子容器瓶中，加入蒸馏水混匀，通入全氟丙烷饱和溶液，采用声振法，超声振荡至形成乳白色液体，制得包裹全氟丙烷气体的普通脂质微泡（），分装于安瓿中，冷藏保存。称取一定比例的、等脂质材料、辅助材料及（亲脂性荧光染料）于容器瓶中，采用同样方法制得荧光脂质微泡（），避光冷藏保存。采用库尔特计数仪测得平均粒径为，浓度约为个。荧光显微镜下：标记的普通脂质微泡发出明亮的红色荧光。二、携抗选择素单抗靶向微泡（）的构建及荧光标记：将、等脂质材料及辅助材料按一定比例溶解于适量蒸馏水中，通入全氟丙烷饱和溶液，采用声振法，超声振荡至形成乳白色液体，制得生物素化脂质微泡（，）。静置弃下清液纯化微泡，利用特异结合系统，先后加入抗生蛋白链菌素及生物素化抗选择素单抗，分别制得链酶亲和素超声微泡（，）和携抗选择素单抗靶向微泡（，）。将与抗生蛋白链菌素（）直接孵育，制得荧光链酶亲和素超声微泡（，）；二抗（抗抗选择素单抗抗体）标记。采用库尔特计数仪测得硕士学位论文平均粒径，浓度个。荧光显微镜下：大小分布均匀，加入二抗孵育后，靶向微泡发出明亮的绿色荧光；被激发出明亮的绿色荧光。三、携抗选择素单抗靶向微泡（）的鉴定：不同荧光标记物分别标记的不同部位，观测微泡荧光强度（、和级）。以作对照，按每个抗生蛋白链菌素孵育、沉淀和洗涤后，荧光显微镜下可见大小均一的微泡发出均匀明亮的绿色荧光（级），而与等量抗生蛋白链菌素直接孵育、沉淀和洗涤后无荧光显示（级）。以两个浓度梯度（：和：）的二抗标记、和，荧光显微镜下可见大小均一的在两个浓度梯度下均发出明亮的绿色荧光（级）；而、仅在：浓度梯度时显示微弱的绿色荧光（级），：浓度梯度时无荧光显示（级）；普通脂质微泡在两个浓度梯度下均无荧光显示（级）。以抗生蛋白链菌素及荧光二抗作为荧光探针，分别标记和。各取个，其中一管作为对照，另一管与孵育、洗涤、纯化微泡，然后用流式细胞仪分析微泡的绿色荧光强度；各取个、和，分别与等量二抗直接孵育、洗涤，用流式细胞仪分析各组微泡与荧光二抗结合率。实验重复三次。流式细胞术（）检测发现：荧光曲线明显右移，即链酶亲和素超声微泡（）构建成功。与二抗的结合率为（士），显著高于和（，），而与的荧光强度无差异（瑚），表明携抗选择素单抗靶向超声微泡（）构建成功。结论、抗选择素单抗通过亲和素桥连特异有效的装配在生物素化脂质超声微泡表面，成功构建了携抗一选择素单抗靶向微泡；、体外荧光法是鉴定靶向超声微泡配体连接可靠性有效、简便的方法，关键词选择素靶向超声微泡荧光流式细胞术硕士学位论文一：”钌，（），、硝，雒“，（）（），硕士学位论文（）：（），（），逗），（），（），：（）：一，一（）诚也，（），（）（）（）（，：晰研（）：，（）研，（）（），（），（）（：）（），（）：，（），弱，、访，；，谢，”、析硕士学位论文（）：，、砘（士），伊，）妒），州（）。：；）缩略词表缩略词表原创性声明南方医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属第一军医大学。本人承诺承担本声明的法律效果。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第一军医大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“寸）：、保密口，在一年解密后适用本授权书。、不保密口。作者签名：导师签名：郯荔乏锄云乞日期：洲年月，日日期：啷年月日硕士学位论文上】一目雷声学造影（，）又称对比超声，是近年来迅速发展的一种无创性评价微循环血流的影像新技术。其原理是经周围静脉注入含有微气泡的声擎造影剂，微泡可通过肺循环抵达左心室，继之进入全身微循环。当微泡通过微血管床时，在超声影像上可见到心肌、肝脏等实质脏器影像对比增强。由于微泡通过组织时完全保持在血管内，微泡的大小及变形性与红细胞相当，可视作一种理想、安全的红细胞流动的示踪剂。靶向超声分子成像是目前分子影像学领域的研究热点，而靶向超声微泡是实现靶向超声分子成像的关键。靶向超声微泡是将配体或抗体装配在超声微泡表面而成。靶向超声分子成像是一门新兴发展的将超声造影技术与靶向超声微泡相结合，依靠微泡表面固有的特性或通过对微泡进行特殊处理，使微泡能滞留在特殊的组织和器官，而对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与成像的方法。靶向超声微泡技术的出现，拓展了传统超声微泡技术的应用范围，其一是发展一种无创性评价各种病变组织和器官的分子学图像，如血管内皮损伤、血栓形成、血管新生和肿瘤等；其二是可能为基因和药物的靶向释放提供新的技术支持，】靶向超声微泡作为靶向超声分子成像的基础，其成功构建是实现靶向超声分子成像的关键。超声造影剂的靶向机制有两种：被动靶向和主动靶向。被动靶向是通过机体本身固有的防御机制，即利用负责清除异物的巨噬细胞吞噬造影剂微泡获得靶向成像或者靶向传输和治疗。主动靶向是通过在微泡表面上装配特异性配体和（或）具有靶向性的单克隆抗体来实现，微泡不需要通过白细胞的介导，直接与病变组织和器官内小血管内皮细胞或血栓等结合。相对于被动靶向，主动靶向具有高度的特异性和靶向性的特点，避免了吞噬细胞对微泡的破坏。因此主动靶向是目前研究的热点，也是靶向微泡构建的主要方式。而在靶向超声微泡的构建上，如何实现相关配体（抗体）与微泡外壳的有效连接是其核心技术，配体前言和微泡外壳的连接效果将直接影响靶向超声微泡的靶向效率及主动特异效能。目前，在配体的连接方法上主要有离子键、物理吸附、耦联剂或桥连剂介导连接等共价结合法或“抗生物素蛋白生物素复合体”桥接的非共价结合，后者因其独特优势而倍受青睐及采用。首先，抗生物素蛋白对生物素有高度的亲和力（以），两者可以在生理条件下迅速形成稳定的结合体；另外，抗生物素具有四个独立的生物素结合位点，可极大的提高信号的强度和探测的敏感性【。为保证配体的高结合性和最大的靶向结合，在微泡外壳与靶向配基之间采用柔软的、可塑形的多聚空间臂，如聚，醇（）作为连接子，这样微泡的靶向性显著优越于将配体直接连接到外壳的方式。其不仅能提供配体与受体结合所需的相对较长的接触时间与更多的接触机会，而且使配基之间的距离达至或更远，以减少结合到微泡表面配基之间的相互影响。脂质分子与生物膜有较大的相似性与组织相容性，具有可变性，有利于配体的装配。因此，通过对脂质微泡表面结构进行生物分子免疫学构建，有望制备出一系列高效、特异的靶向微泡（见图）。选择素在炎症性刺激的数分钟内就在血管内皮细胞表面开始“储存”和表达，因此通过研制针对选择素的靶向微泡，将有望早期评价心脏、肾脏等机体重要器官血管内皮炎症。等应用携抗选择素单克抗靶向超声微泡成功评价了血管炎症，但尚处于试验研究的起步阶段，存在诸多问题亟待解决，而国内目前尚没有相关的文献报道。因此，本研究拟首先制备插入生物素化聚乙烯二醇（，）分子桥的脂质超声微泡，利用生物素抗生蛋白链菌素生物素（）特异结合系统，装配上抗选择素单抗，通过该方法构建的携抗选择素单抗靶向超声微泡，可与血管内皮炎症细胞表达的选择素进行高效的靶向结合。硕士学住论文：图特异靶向脂质微泡生物学构建示意图构建的携抗一选择素单抗靶向超声微泡是否成功，配体的装配效率及靶向性如何，需对其进行鉴定。目前用于观察及评价靶向超声微泡的方法主要有体外与体内评价。体外评价方法：平行板流动腔：荧光标记法：流式细胞仪检测；液相色谱分析等】。体内最常用的方法：通过目测超声造影观察病变部位是否有特异性增强显影；靶部位与周围组织造影后定量分析；病理组织学检查等【幡。通过对靶向微泡的靶向部位进行荧光标记，利用荧光显微镜能直观显示靶向微泡的构建过程，而流式细胞术能对配体结合率进行定量检测，因此本研究拟采用荧光显微镜和流式细胞术对靶向超声微泡配体连接可靠性进行定性和定量检测分析。参考文献【】，列，：打；：。，前言；（）：【】，；（）：【】盯，锄；（）：【】，圮！；（）：【】，；（）：【】，；（）：【】，（）；（）：【】，（）璐；（）：【，氏只；（）：硕士学位论文【】，；（）：【】，：】，（）：【】，（）：【】，（）【】巩，（）：【】，：第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建第一章携抗选择素单抗靶向超声微泡的构建】。一和雷脂质超声微泡主要由脂质双分子层包裹氟碳气体构成。脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相容性，具有可变性，通过对脂质双分子层行化学修饰，装配上不同特异性配体，有望制备出高效、特异的靶向超声微泡，如与内皮炎症、血栓、肿瘤细胞等特异性结合的靶向微泡。本章拟首先制备插入生物素聚乙烯二醇（）分子桥的脂质超声微泡，利用特异结合系统，逐步构建携抗选择素单抗的靶向超声微泡，并对靶向超声微泡的各部位进行荧光标记。材料与方法一、材料（一）实验试剂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇生物素（）：美国公司、二棕榈酰磷脂酰胆碱（）、抗生蛋白链菌素（）：美公司、聚醇（）：德国公司、普洛沙姆（，）：德国、生物素化抗小鼠选择素单克隆抗体（）：美国公司、抗生蛋白链菌素（）：美蟊公司、二氯三嗪基氨基荧光素（，）标记二抗（抗抗选择素单抗抗体）：美国公司、（，一，）：美硕士学位论文国公司、荧光生物素（）：美国公司、蒸馏水、全氟丙烷气体（天津核工业理化工程研究院，纯度）（二）仪器设备、型声振仪（，）、冷冻干燥机（，）、型恒温恒湿培养箱（广东省医疗器械厂）、荧光显微镜：（德匡）、血细胞计数板、，美国；、微量进样器、微量天平（德国）、库尔特计数仪（颗粒计数仪）二、方法（一）普通脂质微泡（）的制备及荧光标记称取一定比例的、等脂质材料及辅助材料于容器瓶中，加入适量蒸馏水混匀，于加热的恒温水浴箱上充分溶解，通入全氟丙烷（）气体饱和溶液，采用声振法，制得包裹全氟丙烷气体的脂质微泡，分装于安瓿中，于冰箱冷藏保存备用。称取一定比例的、等脂质材料、辅助材料及（亲脂性荧光染料）于容器瓶中，采用同样方法制得荧光脂质微泡（），避光冷藏保存。（二）生物素化脂质微泡（）的制各将、等脂质材料及辅助材料按一定比例在水性介质中混合，边摇匀边通入氮气，在恒温水浴箱上，使材料充分溶解。通入全氟丙烷（）气体饱和溶液，采用声振仪，选择合适的功率和第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建时间，超声振荡至形成乳白色液体，制得生物素化脂质微泡（，）。静置浮集上层微泡，弃下清液纯化微泡。将得到的产物进行下一步实验。（三）链酶亲和素超声微泡（）的制备及荧光标记将制备好的生物素化脂质微泡（），参照文献【，按每个微泡加入抗生蛋白链菌素（亲和素）冰上孵育，静置浮集上层微球，弃下清液除去未结合的抗生蛋白链菌素。制得链酶亲和素超声微泡（，），分装于安瓿中，冷藏保存备用。同样方法，将生物素化脂质微泡与抗生蛋白链菌素直接孵育，制得荧光链酶亲和素超声微泡（，），避光冷藏保存。将制得链酶亲和素超声微泡（）与荧光生物素（）直接孵育，制得荧光生物素亲和素生物素超声微泡（，），分装于安瓿中，避光冷藏保存。（四）携抗选择素单抗靶向超声微泡（）的制备及荧光标记将制备好的链酶亲和素超声微泡（），按每个微泡加入生物素化抗小鼠选择素单克隆抗体（￥），冰上孵育，静置浮集上层微球，弃下清液除去未结合的抗体。制备完成携抗选择素单抗靶向超声微泡（，）。将制得的靶向超声微泡，按每个微泡加入荧光二抗（），冰上孵育，静置浮集上层微球，弃下清液除去未结合的荧光二抗，分装于安瓿中，避光冷藏保存。（五）检测各种微泡的理化性质采用库尔特计数仪检测微泡浓度及粒径分布。荧光显微镜观察微泡的形态、大小、分布及荧光情况。硕士学位论文结果一、普通脂质微泡（）浓度、大小及荧光标记普通脂质微泡（）的平均粒径为，浓度约为个（图）。荧光显微镜下：标记的普通脂质微泡发出明亮的红色荧光（图）目，甜。，矿”一州酣一一一：坩静一：一，村：一：耐。、：一，、一“一：，鼍如射一，一蕾一。鼬麓巷魂，魄，粕重一，口尊越童再埘嗣瞳，卅，射，城图用库尔特计数仪测得普通脂质微泡的测量结果；瑟一一。，。鹜第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建圜百。？。于乙备二、靶向超声微泡（）浓度、大小及各部位的荧光标记携抗一选择素单抗靶向超声微泡（）大小分布均匀，微泡平均粒径，浓度个，（图）；存放个月后，微泡平均粒径，浓度个微泡浓度、粒径未见明显变化（图、图）。荧光显微镜下观察：生物素化脂质微泡女标记抗生蛋白链菌素孵育，制得荧光链酶亲和素超声微泡（），微泡发出明亮的绿色荧光（图）：链酶亲和素超声微泡（）加入标记生物素，制得荧光生物素亲和素生物素超声微泡（），微泡发出明亮的绿色荧光（图）；携抗一选择素单抗靶向超声微泡（）加入二抗孵育后，微泡发出明亮的绿色荧光（图）。硕士学位论文阴臣冀瞄，一，。一：一；：耐：，：，；。；：之。：葺一曲譬柳，篇蚺喇，摹捕，盈一工，露？铀，螗簟，嘲。，”毒悄蚋谒囊抽，髓一辅，肼柚图用库尔特计数仪测得携抗选择素单抗靶向超声微泡的测量结果；第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建图图圈、圉分别表示制备后小时和个月的靶向超声微泡（）普通光镜像（）（），警奄：籀、潼：！：皂二。：图荧光链酶亲和素超声微泡（）左图为昔通光镜像（右削为荧光镜像（）硕士学位论文豳一二抗标记捷抗选择素单抗靶向超声撒泡（）左图为普通光镜像（）右图为荧光镜像）（）第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建讨论超声造影（，）又称声学造影，是近年发展起来的一种评价微循环和组织灌注的新技术，超声造影剂与红细胞有相似的血管内流变学特征【】，超声造影成像利用其充当流道显示剂来判定心肌等组织血流灌注的强度和范围。随着基础理论、造影剂和显像技术的迅速发展，从早期的右心显影发展到在毛细血管水平评价组织血流灌注。超声造影已成为超声领域中最前沿的跨学科研究重点，而超声造影剂的研究也得到了快速发展。超声造影剂发展经历三个阶段。第一代超声造影剂主要是包裹空气的微泡造影剂，以、等商用造影剂为代表。其特点是微泡体积小、均匀且可安全通过肺循环，但包裹空气的外壳较厚，谐振能力及稳定性差，在体内持续时间短，容易破裂，虽能达到左心室显像，但不能获取满意的心肌显影。第二代超声造影剂主要为包裹惰性气体的微泡造影剂【】，以为代表。由于采用了血液弥散性极差的高分子氟碳气体作为微泡内的气体构成，使造影剂在稳定性和有效性方面均有突破性进展，经外周静脉注射后可以使血液产生强散射，并在毛细血管内维持较高浓度，使实质性器官显影。其优势在于在合适的超声强度作用下，气泡能够产生非线性震动而不破裂。由于其内包裹的惰性气体分子量大，这类造影剂有溶解度低、稳定性好、微泡能够产生较好的谐波信号等特点，能实现心肌显影。第三代超声造影剂即靶向超声微泡，是在第二代造影剂的基础上，将靶向于病变组织（如炎症、肿瘤、血栓等）特定分子的特异配体（抗体）装配于普通超声微泡外壳构建成靶向微泡。目前尚处于实验研究阶段。靶向超声造影成像（）是新兴发展的将超声造影技术与靶向超声微泡造影剂相结合，能对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与成像的方法。靶向超声造影是目前超声造影的前沿性课题，随着超声造影剂在临床的不断应用与实践，使得超声诊断学与治疗学发生了跳跃式的前进。靶向超声造影技术被誉为超声医学发展史上的“第三次革命”，它的出现大大拓展了传统超声微泡的应用范围，其一可发展一种无创性评价各种病变组织和器官的分子学图像，如血硕士学位论文管内皮损伤炎症、血栓形成、肿瘤血管新生等的分子学成像得以实现，且其有效性已经在各种动物模型的体内外实验研究中得到验证【】；其二可能为基因和药物的靶向释放提供新的技术支持，系列研究表明剐】超声介导的微气泡破坏作用可明显增加基因靶向转染效率，是一种良好的基因传送系统，能经静脉注射达到靶向治疗的目的。本章首先采用声振法制备了普通脂质微泡（）和生物素化脂质微泡（），标记的普通脂质微泡（）在荧光显微镜下激发出明亮的红色荧光。在生物素化脂质微泡（）基础上，利用生物素抗生蛋白链菌素（亲和素）生物素（）配体桥连技术构建了携抗选择素单抗靶向超声微泡（），微泡平均粒径，浓度个，完全可以满足超声造影的需求。靶向微泡放置两个月后粒径和浓度未见明显变化，说明初步制备的靶向微泡已具有相当的稳定性。普通光镜下可见靶向微泡大小分布均匀，荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。用不同的荧光标记物标记靶向微泡的各个部位，均能发出明亮的绿色荧光，说明通过生物素亲合素生物素（）该高效、特异的生物反应系统，微泡靶向部位成功构建。但由于非特异性结合会影响荧光强度，而对结果的判断可能产生干扰作用，因此，在进一步的实验中我们将对靶向超声微泡靶向结构连接的可靠性进行鉴定。结论成功制备了普通荧光脂质微泡、生物素化脂质微泡、链霉亲和素超声微泡和携抗选择素单抗靶向超声微泡；自制的携抗选择素单抗靶向超声微泡大小分布均匀，微泡的粒径、浓度均达到超声造影的要求。参考文献【】，地够，：第一章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的构建【】，蜘，（）：】，、历，（）：【】，（）：】，（）：【】，；：【】，；：【】，诚；：】，【】，埘：硕士学位论文第二章携抗选择素单抗靶向超声微泡的鉴定。一鄹吾构建好的携抗选择素单抗靶向超声微泡，需对其特异性进行鉴定。目前用于评价靶向超声微泡与靶分子结合特异性和有效性的方法主要有：平行板流动腔；流式细胞仪检测；通过目测超声造影观察病变部位是否有特异性增强显影；靶部位与周围组织造影后定量分析；病理组织学检查等。本章拟通过荧光显微镜对携抗选择素单抗靶向超声微泡的构建过程和效果进行定性观察，并利用流式细胞术定量检测靶向超声微泡配体连接的可靠性。材料和方法一、材料（一）实验试剂、第一章已制备：普通脂质微泡（）生物素化脂质微泡（）链酶亲和素超声微泡（）携抗选择素单抗靶向超声微泡（）、抗生蛋白链菌素（）：美公司、二氯三嗪基氨基荧光素（，）标记二抗（抗抗选择素单抗抗体）：美国公司、蒸馏水、全氟丙烷气体（天津核工业理化工程研究院，纯度）（二）仪器设备、荧光显微镜：（德国）、微量进样器第二章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的鉴定、血细胞计数板、流式细胞仪（美国公司）二、方法（一）荧光显微镜观察鉴定靶向微泡链酶亲和素超声微泡（）的鉴定：按制备链酶亲和素超声微泡的方法，每个微泡加入（亲和素）。以普通脂质微泡（）作对照，分别向普通脂质微泡和生物素化脂质微泡（），加入等量，孵育、洗涤、纯化微泡，置于荧光显微镜，对比观察两组微泡的荧光情况。携抗选择素单抗靶向超声微泡（）的鉴定：分别取已经制备好的种微泡（、）各，均分为组，每组包括种微泡：、，各。按每个微泡加入荧光二抗原液（）为标准，将荧光二抗原液倍比稀释，取（：、：）两个浓度梯度的荧光二抗分别标记两组微泡。孵育、洗涤、纯化微泡，置于荧光显微镜，对比观察各组微泡的荧光情况。（二）荧光显微镜观察微泡的荧光标记情况，将不同微泡的荧光图片混杂在一起，由操作荧光显微镜有经验的技术人员在不知道制备方法的情况下，随机抽取图片阅读。并按以下标准进行目测判断荧光强度分级：无或可见微弱荧光，级；：仅能见明确可见的荧光，级；：可见有较明亮的荧光，级；槲：可见明亮的荧光，级。（三）流式细胞术（）检测靶向微泡：标记生物素化脂质微泡（）以证明抗生蛋白链菌素（）结合在生物素化脂质微泡（）表面，即链酶亲和素超声微泡（）的构建成功；二抗标记携抗选择素单抗靶向超声微泡（）以证明生物素化抗选择素单抗桥连在，即构建成功。（）各取个，其中一管作为对照，另一管与孵育、洗涤、纯化微泡，用流式细胞仪分析微泡的硕士学位论文绿色荧光强度及生物素化脂质微泡与（亲和素）的结合率。（）各取个、和，分别与等量二抗直接孵育、洗涤，用流式细胞仪分析各组微泡的荧光二抗结合率。实验重复三次。（四）统计学分析实验数据用均数标准差（）表示，应用统计软件分析。两组等级资料间比较采用检验，多组等级资料间比较采用检验。多组数据间的比较用单向方差分析，两两比较用法检验。尸表示有显著性差异（双侧）。结果一、微泡荧光强度目测判断结果检验结果表明：统计值为，平均秩和最高，说明两组微泡的荧光亮度有显著性差异，且的荧光强度最强“（见表，表）【检验结果表明：在二抗浓度：时：，平均秩和最高，说明各组微泡的荧光浓度有显著性差异，且的荧光强度最强（见表，表）；在二抗浓度：时：，平均秩和最高，说明各组微泡的荧光强度有显著性差异，且的荧光强度最强（见表，表）。第二章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的鉴定表两种徽抗生蛋白链菌素后微泡荧光亮度的目测评价（）（）表两种微泡加入一抗生蛋白链菌素后微泡荧光亮度比较注：硕士学位论文表四种微泡加，入荧光二抗（抗浓度：）后微泡荧光亮度的目测评价（）（：）（）表四种微泡加入荧光二抗（二抗浓度：）后的荧光亮度比较（：）第二章携抗选择素单抗靶向超声微泡的鉴定表四种微泡加入荧光二抗（抗浓度：）后微泡荧光亮度的目测评价（）（：）（）表四种微泡加入荧光二抗（二抗浓度：）后的荧光亮度比较（：）硕士学位论文二、靶向结构的荧光鉴定生物素化脂质微泡（），加入标记的抗生蛋白链菌素孵育后形成荧光链酶亲和素超声微泡（），在荧光显微镜下亲和素超声微泡发出明亮的绿色荧光（级）（见圈）；而普通脂质微泡（）与标记的抗生蛋白链菌素直接孵育后，在荧光显微镜下普通脂质微泡无荧光显示，或可见未被洗净的底色有零星微弱荧光（级）（见图）。图左侧分别为相应荧光标记微泡的光镜所见。抗选择素单抗靶向超声微泡（）、链酶亲和素超声微泡（）、生物素化脂质微泡（）和普通脂质微泡（）分别加入等量的荧光二抗孵育、洗涤、纯化后。在荧光显微镜下在两个浓度梯度下均发出明亮的绿色荧光（级）（见图和见图）。在荧光显微镜下（见图）和（见图）仅在：稀释浓度时显示微弱的绿色荧光（级），而在：稀释浓度时（见图）和（见图）均无荧光显示（级）。在荧光显微镜下在两个浓度梯度下均无荧光显示（级）（见图和见图）。图左侧分别为相应荧光标记微泡的普通光镜所见。：荧光亲和素：荧光亲和紊图：普通光镜像及荧光镜像（）。（）；（）第二章携抗选择素单抗靶向超声微泡的鉴定：图：、分别加入等量、等浓度荧光抗普通光镜像及荧光镜像（）（二抗浓度：），（，硕士学位论文：图：、分剐加入等量、等浓度荧光二抗普通光镜像及荧光镜像（）（二抗浓度：），日，（，三、流式细胞仪检测结果与孵育、洗涤后，微泡的绿色荧光强度明显增强，曲线明显右移，与的结台率在左右（图）。由图、表可知，、和与一二抗结合率分别为为（工）、（）和（），三组微泡的一二抗结合率有显著性差异（，）检验可知的结合率与、两组微泡均有显著性差异（，），的荧光强度明显增强；与的荧光强度无差异（）。第二章携抗选择素单抗靶向超声微泡的鉴定卫正埘咀略，碉广药而研研丽图微泡的的绿色荧光强度直方图醇口硕士学位论支图二抗标记、和微泡的绿色荧光强度直方图时，州船（）表靶向超卢徽泡（）与荧光抗的结合率（曲）（）呵（士）第二章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的鉴定、平行板流动腔鉴定携抗选择素靶向超声微泡（）。影片序列及照片离线分析，选取各分析时间点上张连续照片序列，使用自动把张图片进行合并后均化，假如微泡靶向结合在同一位置，那它还是出现在圈片原来位置上，而在流动腔内滚动及随流动方向游离的微泡，将会看到一阴影轨迹：平行板流动腔实验显示可与（一选择素的段）包被的平行板流动腔靶向结台，幽为包被浓度为，以剪切应力作用下通过流动腔，取点前后张照片进行合并，图中箭头所指拖尾的阴影部分为滚动的微泡，黑色中间透亮部分为牢固结合的微泡（见图）。兰，。，。竺图弗在平行板流动腔实现靶向结台硕士学住论文五、靶向超声微泡的造影效果经静脉注入携抗一选择素单抗靶向超声微泡（）后，在小鼠缺血再灌注（豫）肾脏获得满意的声学造影效果（图）一圈图小鼠肾脏靶向超声造影效果削图为肾脏本底图像图为实验小鼠，肾脏普通腊质微泡（）的灌注显影蚓像蚓为实验小鼠肾脏靶向超声微泡（）的灌注显影削像）讨论血管内皮炎症（猫训龃删乩）作为与心血管疾病发生、发展及预后密切相关的重要病理生理过程，已经在各种临床试验、基础研究及流行病学调查中得到确证，并日益受到人们的重视。研究表明，选择素在炎症性刺激的数分钟内就在血管内皮细胞表面开始“储存”和表达，促进中性粒细胞激活、黏附第二章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的鉴定并聚集于损伤区域的血管内皮细胞，释放多种炎症介质或促炎细胞因子，引起血管内皮炎症的发生及发展，导致组织器官的损伤【叫。因此通过研制出针对选择素的靶向超声微泡，应用靶向对比超声（）这一新兴的超声成像技术对炎症部位进行靶向超声分子成像，将有望从分子水平对多种疾病进行早期的评价和诊断。靶向超声微泡作为靶向超声分子成像的基础，其成功构建是实现靶向超声分子成像的关键。而在靶向超声微泡的构建上，如何实现相关配体（抗体）与微泡外壳的有效连接是其核心技术，配体和微泡外壳的连接效果将直接影响靶向超声微泡的靶向效率及主动特异效能。目前，在配体的连接方法上主要有离子键、物理吸附、耦联剂或桥连剂介导连接等共价结合法或“抗生物素蛋白生物素复合体”桥接的非共价结合，后者因其独特优势而倍受青睐及采用。首先，抗生物素蛋白对生物素有高度的亲和力（以），两者可以在生理条件下迅速形成稳定的结合体；另外，抗生物素具有四个独立的生物素结合位点，可极大的提高信号的强度和探测的敏感性。本研究构建的携抗选择素单抗靶向超声微泡采用生物素抗生蛋白链霉素生物素（）特异结合系统，首先制备表面含有生物素化聚乙二醇（）分子桥的脂质微泡，然后逐步装配上抗生蛋白链菌素和生物素化的抗选择素单抗。生物素亲合素生物素（，）是一种新型生物反应放大系统，具有很强的灵敏度、特异性、稳定性和适应性。因此，靶向微泡制备的每个步骤，都必须去除未结合的生物素化脂质或亲和素以纯化微泡。另外，从靶向微泡中清除未发生交联反应的抗体也是必要的步骤，否则游离抗体将会与靶向微泡外壳上连接的抗体竞争结合靶器官的相应靶点，从而降低靶向超声微泡在靶器官的有效黏附率，导致靶向超声分子成像敏感度的下降。靶向超声微泡构建是否成功，需对其进行鉴定，目前用于观察及评价靶向超声微泡的方法主要有体外与体内评价。体外评价方法：平行板流动腔；荧光标记法；流式细胞仪检测等【。体内最常用的方法：通过目测超声造影观察硕士学位论文病变部位是否有特异性增强显影；靶部位与周围组织造影后定量分析；病理组织学检查掣。本研究采用荧光显微镜和流式细胞仪对靶向微泡进行检测。通过荧光显微镜定性观察，我们可以看到：普通脂质超声微泡（）与标记的抗生蛋白链菌素（亲和素）直接孵育、洗涤后微泡外壳无荧光显示；而生物素，化脂质超声微泡（）加入等量标记的抗生蛋白链菌素（亲和素）直接孵育、经反复洗涤后，在荧光显微镜下外壳仍有明亮的绿色荧光（级）。表明抗生蛋白链菌素生物素化脂质微泡（）制备成功，而且是通过生物素抗生蛋白链菌素（）结合系统，使荧光亲和素与生物素化脂质微泡（）有效结合来实现的。进一步的研究结果显示：携抗选择素单抗靶向超声微泡（），再与荧光二抗直接孵育、洗涤后，荧光显微镜显示；壳在两个浓度梯度下均有明亮的绿色荧光（级）。表明通过特异结合系统，生物素化抗选择素单克隆抗体有效的连接在抗生蛋白链菌素生物素化脂质微泡（）表面上，携抗选择素单抗靶向超声微泡（）构建成功。而和在二抗：稀释浓度时激发出微弱的绿色荧光（级），当释稀浓度为：时和在荧光显微镜下无荧光显示，可能是由于生物素或亲和素与荧光二抗出现非特异性吸附，这种非特异的结合强度较弱、灵敏度低和有明显的浓度依赖性。抗生蛋白链菌素（亲和素）能与生物素特异性结合，利用作为荧光探针标记生物素化脂质微泡（），同理，抗选择素单抗能与二抗特异性结合，可利用二抗作为荧光探针标记靶向超声微泡（），运用流式细胞仪定量检测与的结合率及与盯二抗的结合率。流式细胞术结果显示：生物素化脂质微泡（）入孵育、洗涤后，定量随机计数微泡，其携带标记荧光的抗生蛋白链菌素（亲和素）的百分率保持在左右。由图、表可知：虽然存在非特异性吸附，、都吸附有二抗，但通过抗选择素单抗与二抗的特异性结合，与二抗的结合率为（士），显著高于第二章携抗一选择素单抗靶向超声微泡的鉴定和（庐，）。表明通过生物素抗生蛋白链菌素（亲和素）生物素（）桥连，本研究有效制备了抗生蛋白链菌素生物素化脂质微泡（），并在此基础上，成功构建了携抗选择素单抗靶向超声微泡（）。因此我们也可以得出结论，流式细胞仪是定量检测靶向微泡配体连接效能的有效方法。，总之，体外荧光法是鉴定靶向微泡配体连接可靠性有效、简便的方法，本研究结果显示抗选择素单抗成功通过亲和素桥连有效装配在表面上。对其稳定性、有效性、安全性尚需结合其它方法进一步的研究。结论、成功构建携抗选择素单抗靶向超声微泡；、采用荧光显微镜和流式细胞术定性和定量证明抗选择素单抗成功通过亲和素桥连特异有效装配在生物素化脂质微泡（）表面上。参考文献【】，：，（）：【】，营，（）：【】，：，（）：【】，锁，硕士学位论文，（）：【】，（）：【】，（）：】，：【】，（）：【】，（）：【】，飓【，（）【】，（）：【】，：全文总结全文总结、本研究在国内率先利用生物素抗生蛋白链菌素（亲和素）生物素（）配体桥连技术成功构建携抗选择素单抗靶向超声微泡（），大小分布均匀，平均粒径，浓度个。、我们采用荧光显微镜和流式细胞术率先定性和定量证明抗选择素单抗成功通过亲和素桥连特异和有效的装配在生物素化脂质微泡（）表面上，研究表明体外荧光法是鉴定靶向微泡配体连接可靠性有效、简便的方法。硕士学位论丈成果、郑道文，宾建平，农盛雄，罗建春，王鹏，吴平生。组织多普勒定量评价高血压与冠心病伴或不伴左室肥厚患者心脏舒缩功能。广东医学杂志，（），。、郑道文，宾建平，吴平生。靶向超声造影成像的研究进展。中华超声影像学杂志，（），。、郑道文，杨莉，宾建平，陈少敏，王月刚，吴平生。亲和素桥连构建携抗选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定。岭南心血管病杂志，（）。、郑道文，宾建平，农盛雄，罗建春，王鹏，劳翼，吴平生。组织多普勒成像定量评价左室舒张功能。中国现代医学杂志，、郑道文，杨莉，宾建平，陈楚弟，陈少敏，王月刚，吴平生。亲和素桥连构建携抗选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定。中国超声医学杂志。（已修回）、陈少敏，宾建平，肖文星，杨帆，郑道文等。超声造影评价多巴胺对肾脏血流灌注的影响。中华超声影像学志，（）、陈少敏，杨莉，宾建平，吴爵非，郑道文，刘伊丽。携带抗选择素单抗靶向微泡和对比超声评价肾缺血再灌注损伤。中国超声医学杂志。（已修回）综述综述靶向超声造影成像的研究进展郑道文（综述）宾建平吴平生（审校）靶向超声造影成像是新兴发展的将超声造影技术与靶向超声微泡造影剂相结合，能对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与成像的方法。靶向超声造影是目前超声造影的前沿性课题，随着超声造影剂在临床的不断应用与实践，使得超声诊断学与治疗学发生了跳跃式的前进。靶向超声微泡技术的出现，拓展了传统超声微泡技术的应用范围，其一可发展一种无创性评价各种病变组织和器官的分子学图像；其二可能为基因和药物的靶向释放提供新的技术支持。目前靶向超声造影成像成为影像学领域的研究热点。本文将对靶向超声造影剂的构建策略及靶向超声造影成像在炎症、血管新生及血栓形成等病理生理过程的应用进展作一简要综述。一、靶向造影剂的构建策略超声造影剂与红细胞有相似的血管内流变学特征【】，超声造影成像利用其充当流道显示剂来判定心肌等组织血流灌注的强度和范围。靶向超声造影成像依赖靶向微泡上的特殊配体与内皮细胞表面对应的配基（靶分子）的结合，选择性固定在病变组织上。在自由循环的微气泡被清除后（通常几分钟后），靶向微泡结合的程度通过散射回声增强而被探测出。超声造影剂的靶向机制有两种：被动靶向和主动靶向。被动靶向是通过机体本身固有的防御机制，即利用负责清除异物的巨噬细胞吞噬造影剂微泡获得靶向成像或者靶向传输和治疗。主动靶向是通过在微泡表面上装配特异性配体和（或）具有靶向性的单克隆抗体来实现，微泡不需要通过白细胞的介导，直接与病变组织和器官内小血管内皮细胞或血栓等结合。相对于被动靶向，主动靶向具有高度的特异性和靶向性的特点，避免了吞噬细胞对微泡的破坏。因此主动靶向是目前硕士学位论文研究的热点，也是靶向微泡构建的主要方式。靶向微泡的构建通常有两种策略。第一种用改变微泡外壳的成分使其更容易附着在白细胞等病变组织中的细胞上。例如将带负电荷的磷脂酰丝氨酸（）嵌合到微泡外壳上，由于的加入能增大补体活性，加快补体激活，增强微泡与白细胞粘附，从而制成了靶向白细胞造影剂，并已在诸多实验性应用中初见潜力。等【，】首次成功显示蛋白质和脂质超声微泡，通过激活的白细胞粘附于“炎症”（）组织的小静脉内皮细胞上。他们研究发现蛋白质微泡和脂质微泡与白细胞粘附分子结合的机制不同，蛋白质微泡通过整合素（）的介导与白细胞粘附分子（）结合，而脂质微泡是通过补体的介导与白细胞粘附分子（调理素）结合，脂质微泡与“炎症”组织小静脉内皮细胞的结合效率明显高于蛋白质微泡。第二种常用的靶向策略包括在微泡外壳装配与疾病相关的特异配体，如单克隆抗体、糖蛋白、碳水化合物、多肽或者。一般采取共价靶向结合或非共价靶向结合的方式将配体连接到已制备好的微泡表面。己其中，非共价结合多通过生物素一抗生物素蛋白链连接技术；而共价结合多采用羧酸酯类衍生物介导配体与微泡外壳连接。为保证配基的高结合性和最大的靶向结合，在微泡外壳与靶向配基之间采用柔软的、可塑形的多聚空间臂，如聚乙二醇（）作为连接子，这样微泡的靶向性显著优越于将配体直接连接到外壳的方式。其不仅能提供配体与受体结合所需的相对较长的接触时间与更多的接触机会，而且使配基之间的距离达至或更远，以减少结合到微泡表面配基之间的相互影响。靶向微泡要成功地实现靶向作用，需考虑几个因素：微泡的特性、流变学特征及靶向分子特性。目前用于观察及评价靶向微泡超声造影剂的方法主要有体外与体内评价。体外评价方法：平行板流动腔；荧光标记法；流式细胞仪检测；液相色谱分析；童）评价其免疫活性；茚三酮实验。体内最常用的方法：通过目测超声造影观察病变部位是否有特异性增强显影；靶部位与周围组织造影后定量分析；病理组织学检查，包括病理切片观察病变部位特异性荧光物质显综述影情况，电镜和激光共聚焦显微镜观察微泡在病变部位附着情况。二、靶向超声造影成像的应用炎症成像许多疾病的发生发展都与血管的急慢性炎症过程密不可分，而内皮细胞损伤、血管内皮功能紊乱是这一过程的始动因素与中心环节。血管内皮损伤和内皮“炎症”普遍存在于冠心病、高血压和糖尿病等危及人类健康和生命的三大主要杀手之中。介导炎症发生发展的内皮细胞和白细胞间细胞粘附分子在炎症过程中大量表达，通过研制出针对细胞粘附分子的靶向超声造影剂，对炎症部位进行靶向超声造影成像来评价炎症反应。细胞粘附分子主要有选择素、选择素、等，目前用于靶向超声造影成像研究较多的是选择素、。等【】制备出携抗选择素单克隆抗体的靶向脂质微泡，并以不含抗体的普通脂质微泡和含同型对照抗体的作为对照组。在鼠提睾肌炎症模型上，通过在体显微镜观察发现，与对照组微泡比较，更高效地结合在鼠提睾肌静脉的炎症部位。并对缺血再灌注损伤的小鼠肾脏炎症模型进行超声造影成像，发现能明显增强炎症组织的超声成像信号。等【应用白细胞靶向微泡对缺血再灌注（）的炎症模型进行了组织成像；等【】用脂质体壳的白细胞靶向微泡超声造影图像对犬心肌缺血再灌注（）模型进行了在体无创观察，发现用这种白细胞靶向微泡进行超声造影，能评价缺血再灌注损伤所致心肌炎症的空间分布和时间分布。研究显示，靶向超声造影图像显示的炎症范围与检测的炎症范围相似，而前者有获得序列靶向图像的能力，能提供同一动物不同时间点心肌缺血再灌注后炎症信息，可以无创地、动态地观察缺血再灌注后心肌炎症情况的变化，未来或将可以用来评估减少再灌注损伤治疗新方法的治疗效果。动脉粥样硬化的发展均伴随着和水平的增高，并与病变的严重程度成正比。应用超声活性脂质体行血管内超声成像已用来检测猪颈动脉炎症硬化模型的和，研究表明造影剂在高切应力动脉血管内也能与这硕士学位论文些靶分子目标附着【】。最近针对，靶向超声造影成像已用来评价轻至重度动脉硬化疾病大鼠模型的炎症反应。等】研究发现：在急性心脏移植排斥反应时，内皮细胞上有细胞间粘附因子）的大量表达，通过制备出结合抗抗体的靶向造影剂，当经外周静脉注入造影剂后，则在心脏排斥区通过抗抗体与内皮细胞上的相结合，可促使超声造影剂在排斥区滞留，局部造影剂浓度增加。肠炎时肠小静脉黏膜地址素细胞粘附分子（）过度表达，等【】通过对小鼠肠炎模型的超声造影成像，发现携抗的靶向微泡能明显增强炎症组织的超声回声信号。表明靶向超声造影成像应可用于对心脏移植排斥反应和克隆氏病（炎症性肠疾病）的检测。血管新生成像血管新生是肿瘤、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎及动脉粥样硬化等疾病状态的重要过程。运用靶向超声造影技术使新生血管分子成像，对这些疾病进行早期诊断，已在许多动物实验中取得显著进展。新生血管内皮细胞选择性上调整合素，因此通过制备携抗整合素单克隆抗体的靶向超声微泡，可使新生血管分子成像。尝亭】利用新生血管靶向微泡的超声造影图像，在体观察血管新生，他们把脂质微泡表面连接上整合素单克隆抗体或者整合素，这种微泡与新生血管内皮合成的（整合素的靶向结合实现靶向新生血管超声造影成像。在体显微镜和超声造影观察结果证实，这种靶向微泡在血管新生处滞留增加。用新生血管靶向微泡进行的超声造影可对微血管形态成像，通过显示新生血管数量和空间分布来评估微血管对生长因子的早期反应，为评估血管新生提供更多信息。这些信息对指导向缺血组织局部输送促血管合成蛋白或基因十分有用。肿瘤生长依赖于丰富的氧和其它营养物质，为此肿瘤通过新生血管来增加血液供应，使肿瘤生长迅速；同时，新生血管表达大量的特异性抗原，如、等。因此新生血管形态的成像将为检测肿瘤和判断肿瘤预后以及评估肿瘤对治疗的敏综述感性提供信息。等】应用与相刚拘鳓单克隆抗体微泡，发现超声造影可定位性评价恶性胶质瘤的新生血管分布，肿瘤的外周新生血管密度最大，这是因为实质肿瘤的生长主要取决于神经血管的生长和整合素表达。而】利用能与肿瘤新生血管内皮细胞高度结合的三肽精氨酸精氨酸亮氨酸（，），作为配体与微泡连接，显像小鼠肿瘤，同样发现肿瘤新生血管区域相对正常组织血管区明显增强。实验显示靶向超声造影可能成为早期发现肝脏肿瘤的影像学新方法。卞爱娜等【】将单抗结合到自制的脂质体微泡上，在体外试验中能与人肝癌细胞高效特异结合，可望下一步研究实现肝细胞癌靶向显影。这些研究结果表明超声造影与特异的靶向微泡结合，不仅能评价新生微血管，且可实现超声对恶性肿瘤及转移灶的早期诊断；并有利于超声引导下活检时对肿瘤组织生长活跃区的准确选择。血管内血栓成像原位血栓和血栓栓塞是许多心脑血管疾病的重要病因之一，而冠脉内微血栓是早期心肌再灌注治疗后“无复流”（）现象的最主要机制。动物实验发现，利用靶向超声造影技术，可使血管内的血栓成像，能早期准确和敏感地探测到心脏内、颈动脉和主动脉内易损粥样斑块以及冠脉微循环内的血栓。激活的血小板表面表达高密度的血小板膜糖蛋白受体，能促进血小板的聚集和血栓形成。精氨酸甘氨酸天冬氨酸（）多肽序列是血小板膜糖蛋白受体特异性的识别、结合位点。与微泡结合成血栓特异性靶向微泡造影剂，有可能为血栓的诊断、治疗提供一种无创、有效、价廉的新方法。（，）是一种血栓靶向的脂质体微泡。它在脂质微泡的表面连接了一个可被受体精氨酸甘氨酸天冬氨酸（）结合位点识别的寡肽序列，在超声作用下可提高对血栓的识别能力。显微镜观察显示靶向微泡粘附到人血栓上，体外超声显示血栓成像增强。等进行动物体内实验也证实能与血栓特异性结合，明显提高了超声对左房和静脉内微小血栓的显示，而且在增强声像图上测得的血栓符合实际大小。硕士学位论文除了能探测心脏、动脉及静脉血栓外，血栓特异性靶向微泡在治疗领域还有广阔的临床应用前景。实验发现，将高浓度微泡结合于血凝块表面还有助于溶栓的可能，暴露于高能超声后，血凝块附近的微泡破裂能加速溶栓治疗，而且能在无药物溶栓治疗时使血凝块溶解。实验证明微泡在靠近血栓部位的破裂作用是辅助血栓溶解的治疗机制【引。三前景与展望靶向超声造影成像已成为影像学领域的研究热点，尽管其目前仍处于实验研究的起步阶段，面临诸多挑战和技术难题，但其高特异性、高敏感性、相对无创性、靶向定位及早期定量评价等特殊优势是其他影像学技术和传统检测手段所不能比拟的。随着生成微囊的高分子材料快速发展和微泡制备工艺的不断完善，靶向超声造影剂必将朝着更加个性化的方向发展。靶向超声微泡不仅能应用于不同生理和病理状态下的超声造影成像，有助于早期诊断疾病；而且可利用靶向超声微泡作为携带药物或治疗基因的载体，将可能为临床治疗领域带来革命性的进展。参考文献【】，眠，：【】，：【】，：【】，综述、航，：【】，埘，：【】，：，：【】，、析，：【】，（），：【】，：【】，谢廿（），：【】，：【】，憾，谢，（）：￥硕士学位论文【】卞爱娜，高云华，谭开彬，等免疫脂质体微泡造影剂的制备及体外靶向研究中国医学影像技术，（）：】，也（）：，：【】，：硕士学位论文致谢首先，感谢我的导师吴平生教授和宾建平教授，忘不了他们的淳淳教诲，忘不了他们的用心良苦：是他们的精心教导、倍加爱护使我克服了重重困难；是他们高尚的人格、渊博的知识、严谨求实的科学态度、敏锐迅捷的逻辑思维使我受益终身！三年来，在学习上他们悉心指导，耐心讲解，不厌其烦；在工作上他们将丰富的临床经验毫无保留的悉心传授；在生活上他们处处为我着想，给予了无微不至的关怀。为了我的学业能圆满完成，他们花费了大量宝贵的时间和精力！从课题的设计、实施、总结到论文的撰写、修改都凝结了他们的大量心血。在这里我衷心感谢我的导师吴平生教授和宾建平教授！我将努力在以后的工作和学习中取得好的成绩，以不辜负导师的教诲和期望。特别感谢南方医院药学部杨莉老师对我实验课题的悉心指导！衷心感谢刘伊丽教授、张远慧教授、黄铮副教授、修建成副主任医师、马立勤副主任医师、郑华主治医师在临床学习期间对我的倾心培养，你们精湛的医术和高尚的医德令我终身难忘。衷心感谢许顶立主任、贾满盈副主任、吴赛珠副主任、侯玉清教授及全体专家教授给予的支持和帮助。衷心感谢心内科超声心动图室谢志斌主任、王鹏副主任技师、刘俭主管技师、杨京山技士给予的支持和帮助。衷心感谢藤中华护士长、屠燕护士长及全体护士在我临床学习期间对我的悉心指导和热心帮助！感谢学校、研究生学院及南方医院各