一种用于活细胞DNA MMR活性分析的EGFP异源双链DNA的构建.doc

温州医学院硕士学位论文一种用于活细胞DNA MMR活性分析的EGFP异源双链DNA的构建姓名：周必胜申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：黄长江;孙鲁浙20090501 功 能 活性进 行 监测分析 具有重 要意 义 。然 后 ， 在 第 一部分获 得 正常表 达质 粒 甅 甧 瓺 遗传性 非 息肉病 性 结 直 肠 癌微 卫 星 不稳定 性 本 人完 全 了解 温 州 医学院有 关 保留、使 用 学位 论 文 的 规定 ，学校 有 权保留学位 论 文 并 向国 家主 管 部 门 或 其 指定 机构 送 交 论 文 的 电子 版 和 纸 质版 。 有 权将学位 论 文 用 于非 赢利目的 的 少 量复制并 允 许论 文 进入 学校 图书馆 被 查 阅。 有 权将 学位 论 文 的 内 容 编 入 有 关 数据 库 进行 检 索 。 有 权将 学位 论 文 的 标 题 和 摘 要 汇编 出 版 。 保密 的 学位 论 文 在解 密后适 用 本 规定 。 ， 】 与散发 性 结 直 肠 癌 瑂 街 諨 分 子 。首先用限制 性 内 以 寡聚核 苷 酸为材 料 】 ：采 用人 工 合成的 寡聚核 苷 酸作为含 有错 配 碱基 的 温 州医学院硕士学位论 文 珽 基 因 作为报 告 基 因 直 接 对活 细 胞 活 性 温 州医学院硕士学位论 文 第 一部分 突 变 型 质 粒 的 构建 与 鉴定 大肠 杆 菌 菌 株公 司 产 品，胎 牛血 清 购自杭 州四 季青 生 物 科 技 公 司 。H臼 约 粒 簂为 公 司 产品。 妊刮 攘 餍偷 缬 疽 ： 北京六一仪器 厂 水浴锅 ：太仓 市 科 技 器 材 厂三 、 实 验 方 法模 板 质 粒 与 的 转 化 ，小 量制备、 鉴定 与 保藏 称 取下列 试 剂，置于 烧杯中。渲 芤 骸 娜 胱 铀 腥芙 高 温 高 压灭菌 。 加入 预 温 好的 嘌 怪仗 寤猯。 质 粒 与 的 小 量制备、 鉴定 与 保藏具体操 作 如 下 ： 管内液 体。集 管 内液 体。 将质 粒 纯 化 柱置于 离 心 管 上 ，加入 溶液 凉苣 谥嫔 希胖 洲州叫哪叫州 温 州医学院硕士学位论 文步骤时 间在 电 泳 检 测 确认后 姆 从逑抵 屑 尤 雔山，混匀 后 。 跤 小 时 。废 液 收 集 管 温 州医学院硕士学位论 文最 高 速 离 心 种 樱靡禾寮 次8叽慷 鹊 腄 。 温 州医学院硕士学位论 文反 应 结 束 后 ， 质 粒 与 的 转 化 ，小 量 制 各 、 鉴 定与保 藏对 小 量 制 各 的 质 粒 和 电 泳检 测 结果 如 图 ： 糽 阌 毡 洳 镌诰璂 痛 炕 螅 糜谧 ;疛 感 受 态 细 胞转 化 结果 见图 。直接 涂布平 板 无 菌 落克隆 皓 出 。 酶切鉴 定对 转 化 出 来 的 克隆 逐个挑 取培 养小 量 提取质 粒 ，然 后用 节酶切，进行 初 步 砸 兀 籣 田 妓猑 皿 基 谴 瞳 佟鲐 誰 匠 躺渲鍭 日日 ! 宋 鱁 瞄 田 堰口 一 瞄蕾 鲎梏 甴 墨昏 口 田 觥 褚 籰 蕾簖 直雕 龌槟 鋉 田 断 鯻 “一 曩 鰈 ？ 丁 辍 ，； 鐆 温 州医学院硕士学位论 文 讨 论 襄 猳除 诱变产 物 中 的 少量 残 留野 生型模板质粒 。 同 时 ， 我 们 把 消 化 后 的 产 物 用 温 州医学院硕士学位论 文全 部 用 于 转化。结果 显 示 ，经 过 这样 一 系 列 优化后，转化克 隆 效 率在 以上 。对 转化克 隆 的 鉴 定 也是 我 们定 点 诱 变 的 最 重 要环 节之 。我 们先挑 取 转化平 板上 的 若 干 单 克 隆 分 别 接 种 培 养 后保 种 并 提 取 质 粒 ，对 所提 取 的 质 粒 首 先限制性内切酶 和 分 别 酶切电 泳 初步 鉴 定 ，然后从 酶切鉴 定 正 确 的 克 隆 中选取 个 克 隆 去 测 序 ，结果 显 示 我 们测 序 结果 全 部 与 预 期 一 致。表明 我 们的 定点 诱 变 效 率极 高。码 子 。突变 后的 新 质 粒 和 在 效 果 上 应 该 满 足 完 全 终 止 的 表达，对 此，我 们进 行 了 效 果 鉴 定 。分 别 以 、 、 和 转染 活 细胞后，用 荧光显 微 镜 和流式 细胞仪 分 别 对 的 表达进 行 了 观察 和精 密 分 析，鉴 定 结果 显 示 ，不 同于 仍 有 部 分 表达， 和 在 细胞中 已完 全 检 测不 到 表达，与 空 白 对 照 没 有 差异 ，表明 和 的 点 突变 成 功 达到 了 的 表达；经 转染 细胞验 证，通 过 该 位点 碱 基的 改变 ，成 功 终止了 的 表达； 材 料与方 法物 科 技 公司。 妊刮 攘餍偷 缬 疽 ：北京六一仪器 厂 贤夥 止 夤 舛 燃 ：日 本 岛津 公司 水浴锅 ：太仓 市 科 技 器 材 厂 液 体 培养基 及 固 体 平 板培养基 在消毒 的 超 净工 作 台下 ，按 照 每 嘌 杭 的 比 例 向 培养基 中 加入辅 助 噬菌 体 ，摇匀， 封 口 ，放 回 恒温 振 荡摇 床 放 置 纸 巾 吸 去 瓶壁和 颈 上 残 留 的 上 清 。 腡 瓾 ， 搅动瓶中 溶 液 ， 并 用 巴 斯德 温 州医学院硕士学位论 文 和 乙 醇 。充 分 混 合 后 室 温 放 置 分 钟 。 每 个 离心 管 中 加入 离心 分 钟 ， 小 心 尽 可 噬菌 粒 高 纯 目 焖 俑 咝 票 阜 】 狧 ， 温 州医学院硕士学位论 文温 培养箱 中 过 夜 培养， 作 为 对 照 。从 姹 渲 腥 龀 蠮 复 合 体 克 隆的 新 鲜 平 板， 分 别 挑 取温 振 荡摇 床 古 嘌 。过 程 同 提取 质粒 时接种 放 置分 钟 ， 期间 混 匀几次。 分 别 将两 个 硅胶 膜吸 附 柱 置于两 个 干 净的 的 离心 管 中 ， 将上 一步 得 到 的 电 泳检 测 并 同 时取 刑 崛 膕 电 泳对 照 。 质粒 逋 庵 票 阜 】 向 上 述缺刻 酶 处 理过 后 得 到 的 产 物 中 添 加如 下 组分 ：混 匀， 跤 种 印 孵 育 分 钟 终 止 反应 。解 ， 然 后 置于微 量离心 机 中 痬 离心 秒 ， 使 管 壁上 的 溶 液 集 中 于瓶 温 州医学院硕士学位论 文分 钟 ， 终 止 反应 。 异 源双链核 酸分 子 的 制 备【 ， 】 洗 脱， 洗 脱得 到 的 溶 液 即 为 高 纯 度 的 线性化 溶 液 。取 电 泳检 测 。 步 骤 艘 钚苑 治 鲅橹 】用 紫外 分 光 光 度 计测 定 上 一步 制 备的 异 源双 链核 酸分 子 的 浓 度 。并 用 分 光 光 度 法定 量。 甅 韵 赴 鸋 癕 性 的 培养 细 胞 用 培养基 加上 的 胎牛 血 清 培养， 基 加 的 胎牛 血 清 培养。在细 胞 培养箱 中 以 腃 图 笔 烧禾 逶 靥 宓 粗票 阜 玫降膕 挠乘俑 咝 票 阜 椒 紫壬 秆玫搅 薐 一固 温 州医学院硕十学位论 文 ： 巾 璂 纯 化后的 电 泳 结果 中 璂 纯 化后的 电 泳 结果 炕痵 的 效 果 验证 誉 即 瓻 是 一 个 温 州医学院硕士学位论 文理 是 运 用 缺刻 酶 咝 曰蚧 纷 磗 ， 但 对 双 链环 状 包括 缺刻 型 双 链 却没 狣 竦 玫 腅 煸 椿底 磀 转 染 错配 修 复 活 性正 常 的 细 胞 和究 方面 的 科 学价 值； ， 系 统 广泛存在 于 生 物 体 中 ， 它 是 细 功 能 完善的细 胞 提 取 物 作用， 缺刻 会指 导错配 修 复 蛋白以正链为模 板， 修 复 负 链错配 或未 配 对 的碱 基 。 再 次转 化 ， 指 示 板上 的混 合 噬斑 比 率 会下 降 ， 而正链表型 的噬斑 比 率 会增加 。 通 过 计 算混 合 噬斑 比 率 的变 化， 就 可了解检测 样 本的错配 修 复 功 能 活 性 。功 能 状 态， 结 合 测 序 ， 对 各 种 突变 的病理 性 质 做 出评 价 。 钚 越 卸 糠治 龅哪 汀 緇。 该模 型 的原 理 是 构 建一对 基 ， 可以在 细 胞 中 正常 地 表达 绿色 荧 光 蛋白； 另一个为带 有 一个错 ： ， 產 甌 ，