高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子nf.doc

高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子NF作者：徐会圃，刘长梅，冯义柏【关键词】,甲硫氨酸EffetfhysteinenexpressinsfNFBandprtngeneinballninjuredratartidarteries 【关键词】 ,甲硫氨酸 Effet f hysteine n expressins f NFB and prtngene in ballninjured rat artid arteries 【Abstrat】 AI: T study the effet f hysteine (Hy) n the expressins f nulear fatrB (NFB) P65 prtein and fs, jun RNA in n artid artery f rats after balln injury and t explre the pssible ehanis by hih hysteine exaerbates neintial hyperplasia after angiplasty. ETHDS: The expressins f NFB P65 prtein and fs and jun RNA ere deteted by estern blt and seiquantitative RTPR respetively in the n artid artery. RESULTS: The expressins f NFB P65 prtein and fs and jun RNA ere signifiantly higher in l ethinine (L) grup（1.120.13, 1.400.21, 1.430.25）（P 0.05） and high ethinine (H) grup（1.500.37, 1.680.27, 1.710.30）（P 0.01）than thse in ntrl grup（0.640.06, 1.100.15, 1.000.13）. The expressins f NFB P65 prtein and fs, jun RNA ere als signifiant higher in H grup than thse in L grup (P 0.05). NLUSIN: Hysteine ay upregulate the transriptin f fs and jun RNA in n artid artery after balln angiplasty by NFB pathay, hih ay be respnsible fr neintial hyperplasia indued by hysteine after angiplasty. 【Keyrds】 ethinine; hysteine; balln injury; NFkappaB; prtngenes 【摘要】 目的： 观察高蛋氨酸饮食诱导的高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织NFBP65蛋白和原癌基因fs及jun RNA表达的，探讨同型半胱氨酸在血管球囊损伤后新内膜过度增生中的机制. 方法： 采用estern blt及RTPR方法分别检测血管组织NFBP65蛋白和fs及jun RNA表达，并做半定量分析. 结果： 低、高蛋氨酸组血管组织NFBP65蛋白、fs及jun RNA的表达均高于对照组，分别为1.120.13 vs 0.640.06 （P 0.05）, 1.500.37 vs 0.640.06 (P 0.01), 1.400.21 vs 1.100.15 （P 0.05）, 1.430.25 vs 1.100.15 （P 0.01）及1.680.27 vs 1.000.13 （P 0.05）, 1.710.30 vs 1.000.13 （P 0.01）,高蛋氨酸组也高于低蛋氨酸组(P 0.05). 结论： 同型半胱氨酸有NFB通路上调血管内皮损伤后动脉组织原癌基因fs及jun RNA的表达，这是其血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的机制. 【关键词】 甲硫氨酸；同型半胱氨酸；球囊损伤；原癌基因；NFB 0引言 实验和临床观察表明，血中同型半胱氨酸(hysteine, Hy)升高可引起动脉粥样硬化和血栓1-2. 然而其在血管内皮球囊损伤后新内膜增生中的作用及其机制尚不清楚. 用高蛋氨酸（ethinine）饮食诱导高同型半胱氨酸血症，观察其对血管内皮球囊损伤后血管组织NFB P65蛋白及原癌基因表达的，以探讨Hy血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的机制. 1材料和方法 1.1材料 健康雄性12 k SD大鼠30只(华中科技大学同济医学院动物中心)，体质量280320 g，随机分为对照组（）(给普通饲料)，低蛋氨酸组(L)(含蛋氨酸12 g/kg饮食),高蛋氨酸组(H)（含蛋氨酸20 g/kg饮食），每组10只，各组均自由进食. 蛋氨酸(北京中生物技术有限公司，化学纯，批号： 1903001)，总RNA提取试剂(Trizl)及逆转录试剂盒为Gibl公司产品，TaqDNA聚合酶fs, jun及内参atin上、下游引物为TaKaRa大连宝生物工程有限公司产品；兔抗大鼠NFB P65多克隆抗体、estern blt检测试剂盒均购自武汉博士德公司. 自制2F球囊导管购自天津乳胶制品厂；PR扩增仪(美国JP150公司)，图像分析仪为上海四星公司产品. 高效液相色谱仪(美国ater公司). 1.2方法 1.2.1动物模型及标本采集动物喂养4 k后，体质量(350400) g,禁食12 h，用30 g/L戊巴比妥钠注射麻醉(30 g/kg, ip). 沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左右颈内、外及颈总动脉，结扎左颈外动脉的远心端，用微动脉夹夹住左颈总动脉的近心端及左颈内动脉，切开左颈外动脉的近心端，然后将自制2F球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉至起始部，球囊注入生理盐水，使其扩张致有轻度阻力感，然后回拉球囊使球囊达颈动脉分叉处，重复3次，后负压回抽球囊中的生理盐水，取出球囊导管，结扎左颈外动脉. 以右侧颈总动脉对照，只分离血管但不做球囊损伤. 术后1 h，每只动物心脏采血2 L,立即3000 r/in离心15 in，-20冻存待测. 然后脊椎脱臼法处死动物，并立即取左右颈总动脉液氮冻存备用. 1.2.2血浆同型半胱氨酸及蛋氨酸测定每只动物采血2 L,置于20 g/L EDTANa2的试管中，混匀，30 in内，标本于4用3000 r/in离心15 in，分离出的血浆移入的EP管，-20冻存，留做血浆Hy和蛋氨酸检测，血浆Hy检测按文献3的方法稍作改良，采用高效液相色谱仪测定血浆Hy，所用试剂批内变异系数 5%,批间变异系数 10%. 血浆蛋氨酸测定应用日立83550全自动氨基酸分析仪，采用阳离子交换树脂、分离和茚三酮显色等方法测定. 1.2.3estern blt法检测血管组织NFBP65蛋白的表达参照博士德公司的蛋白提取方法,用缓冲液裂解颈总动脉组织组织总蛋白. 以牛血清蛋白标准品,蛋白定量试剂盒的说明绘制蛋白定量标准曲线,于紫外分光光度计750 n下测光密度值,计算蛋白提取液的浓度. 将优化表达的NFB P65蛋白用100 g/L聚丙烯凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上,封闭后,先加兔抗鼠NFB（P65）多克隆抗体（1500）,再加辣根过氧化物酶的驴抗兔多克隆抗体(1500),用化学发光法显影，用图像分析系统测定吸光光度值，NFB P65蛋白的表达量以光密度的比值表示. 1.2.4fs, jun RNA表达的检测 引物序列如下： fs上游： 5TAGAGGAGATGTTGTG3,下游： 5GGTAGTTGTGAAT3，扩增片段331 bp. jun上游： 5GTGAAGTGAGTG3下游： 5AGTTGGAATGTTAA3 扩增片段490 bp. atin上游： 5TAAGGAAGTAAAG3下游: 5TTTATGGTGTAGGAGA3,扩增片段623 bp. 总RNA抽提和DNA链的合成： 用Trizl试剂抽提左右颈总动脉组织总RNA，各RNA样本A260 n/A280 n的比值均在1.82.0之间，用逆转录试剂盒合成DNA链. PR反应条件： 基因反应条件如下，94预变性2 in，PR循环： 94 30 s, 55 30 s, 72 40 s,共35个循环，结束前72延伸7 in;内参反应条件： 94预变性2 in, 94 20 s, 62 30 s, 72 30 s;共28个循环，结束前72延伸7 in. PR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用生物凝胶电泳图象分析系统对电泳条带灰度积分，并以atin校正. 统计学： 所有数据以xs表示，组间采用方差分析和SNKq检验，统计用SPSS统计软件，P 0.05为有统计学意义. 2结果 蛋氨酸组血浆蛋氨酸和同型半胱氨酸浓度均高于对照组(P 0.01),低、高两组之间也有差异（P 0.05，表1）. 低及高蛋氨酸组NFB P65蛋白表达与对照组有差异（P 0.05, P 0.01）,低高两组之间差异也有性12下一页 【 （P 0.05，表2)；右颈总动脉组织有微弱表达（0.130.03). 低蛋氨酸组及高蛋氨酸组fs及jun RNA的表达与对照组比有差异(P 0.05, P 0.01),低蛋氨酸组与高蛋氨酸组相比也有差异(P 0.05) （表1，图1A, B, )； 右颈总动脉组织fs 及jun RNA仅有微弱表达，分别为0.580.07和0.490.06(图1A, B, ).表1各组喂养4 k后血浆蛋氨酸和Hy(略) 表2各组血管组织NFB P65蛋白和fs, jun RNA表达的（略） 3 的实验结果表明短期高蛋氨酸饮食，可以引起高蛋氨酸血症，而且可引起高Hy血症. Hy在动脉粥样硬化中的作用已文献资料的认可；最近高Hy血症加重了球囊损伤大鼠颈动脉新内膜的增生4，但其在血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生中的机制，尚不清楚. 表明，血管内皮球囊损伤后的早期，血管壁组织原癌基因fs及jun的表达即上调5，在1 h左右达高峰. 的实验结果表明在血管内皮球囊损伤后1 h处死动物，在对照、低蛋氨酸及高蛋氨酸组fs, jun RNA的表达均高于右侧颈总动脉，右侧颈总动脉仅有微弱表达，且其表达与Hy呈浓度依赖关系， 说明Hy对fs及jun的表达有激发作用. 原癌基因fs及jun的表达产物活化后可活性蛋白1(Ativatin prtein1, AP1),是细胞核内的转录因子，可激活细胞核DNA转录和核蛋白的合成，调控细胞增殖分化和转化等生物学6，使血管平滑肌细胞可增殖周期并功能，由收缩型转变成活成型. 此外，原癌基因fs及jun的转录产物还可介导多种细胞因子，是生长因子的表达. 这就启动了损伤血管局部平滑肌细胞活化的自分泌、旁分泌机制，损伤动脉局部将有持续的血管平滑肌细胞过度增殖和分化，从而有利于血管内皮球囊损伤后新内膜的过度增生而再狭窄. 本实验涉及的NFB P65是NFB家族/Rel家族的组成，显示，在细胞中最常见的为P65及P50组成的NFB异二聚体，情况下与其抑制物IB，于细胞的的胞质内，多种刺激信号，如细胞因子、氧自由基、细菌和病毒产物等可以引起IB的磷酸化和降解，NFB脱离NFB: IB复合体，迅速移位于核内，与特定的基因启动子B位点，诱导基因的表达7，如细胞因子、原癌基因、黏附分子等. 的实验了NFB P65蛋白在低高蛋氨酸组和对照组大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织中的表达，结果低、高蛋氨酸两组的表达与对照组有差异（P 0.05, P 0.01）,且低高蛋氨酸组两组之间也有差异（P 0.05）. 提示NFB了Hy介导的平滑肌细胞fs, jun RNA的表达，这也许是Hy加重血管内皮球囊损伤后新内膜增生的机制. ang等8近期，Hy可刺激血管平滑肌细胞NFB的激活，从而使平滑肌细胞表达和释放单核细胞趋化因子，也支持的. 但关于Hy诱导NFB活化进而诱导原癌基因表达的胞内信号机制，有待于今后阐明. 【参考文献】 1 Haynes G. Hyperhysteineia, vasular funtin and atherslersis: Effets f vitains J. ardivas Drugs Ther, 2002,16(5)391-399. 2 asileska A, Narkieiz , Rutkski B, et al. Is there any relatinship beteen lipids and vitain B levels in persns ith elevated risk f atherslersis J? ed Si nit, 2003,9(3):147-151. 3 Ueland P,Refsu H, Stakler SP, et al. Ttal hysteine in plasa r seru: ethds and linial appliatin J. lin he, 1993,39(9):1764-1779. 4 徐会圃，冯义柏. 高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉损伤后新内膜增生的J. 康复医学杂志，2004,19（2）:115-117. 5 ian J, Vlasi N, Tta RR, et al. Sth usle ell iediateearly gene and