DB21∕T 2209-2013 海绵种属分子生物学鉴定技术规程.pdf

ICS 65.150 B51 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 22092013 海绵种属分子生物学鉴定技术规程 Technical Specification of Identifying Sponge through Molecular Biology Techniques 2013 - 12 - 12 发布 2014 - 01 - 22 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB 21/T 22092013 I 前 言 本标准是按照GB/T 1.12009给出的规则起草的。 本标准由大连海洋大学提出。 本标准由大连市质量技术监督局归口。 本标准主要起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所 本标准主要起草人：付晚涛、郑长波、曹旭鹏、苏延明、宋悦凡、潘勍宇、安宗福。 本标准于2013年*月*日首次发布。 DB 21/T 22092013 1 海绵种属分子生物学鉴定技术规程 1 范围范围 本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的总则、海绵样品采集与保存、海绵种属鉴定方法。 本标准适用于海绵的样品采集、保存、处理和种属分子生物学鉴定方法。 2 术语和定义术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 海绵海绵 海绵 （Sponge） 是最低等多细胞动物 （Metazoan） ， 在动物界中单独构成多孔动物门 （Phylum Porifera） 。 2.2 海绵分子条码海绵分子条码 海绵的细胞色素氧化酶亚基（cytochrome oxidase subunit ，简称COI）的DNA序列为海绵的保 守基因序列信息，作为海绵分子条码。 3 总则总则 3.1 原理原理 海绵细胞色素氧化酶亚基（COI）的 DNA 序列为海绵的保守基因序列，作为海绵分子条码，用 于鉴定海绵种属。通过分子生物学技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR） 扩增海绵的 COI 基因部分序列，测序后与已经鉴定海绵的 COI 基因序列比对，以此鉴定海绵的种属。 3.2 仪器与设备仪器与设备 野外生物样品保存箱或泡沫保温箱； 高速低温冷冻离心机； 普通 PCR 仪； 水浴锅； - 80冰柜。 3.3 试剂与材料试剂与材料 无水乙醇（分析纯）； 液氮； 细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris- Cl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.1%(m/V) SDS）； 异丙醇（分析纯）； DB 21/T 22092013 2 醋酸甲溶液（60ml 5 mol/L 醋酸钾；11.5 ml 冰醋酸；28.5 ml 超纯水）； 细胞裂解液（20 mmol/L Tris- Cl，pH 7.6）； 蛋白酶 K（20 mg/ml）； TE 缓冲液（pH 7.6）（100 mol/L Tris- Cl，pH 7.6；10 mmol/L EDTA，pH 8.0）； 超纯水； PCR 酶(5U/L)； 10PCR 缓冲液 （500 mmol/L KCl； 100 mmol/L Tris- Cl， pH 8.3； 15 mmol/L MgCl2， 在 1.05 kg/cm2 高压灭菌 10min）。 4 海绵样品采集与保存海绵样品采集与保存 4.1 对于潮间带海绵，在海水退潮后，先拍照或摄像，再用金属或木质的小板采集海绵样品于塑料采 样瓶中，立刻加入 75%乙醇浸没海绵样品并超过 2 cm 以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外生 物样品保存箱，用于分子生物学鉴定。 4.2 对于潮下带海绵和深海海绵， 采样器采集海绵后放入塑料采样瓶中并在瓶中装满样品附近的海水。 装有海绵样品和海水的样品瓶被带上船或带上岸后，倒掉采样瓶中海水，立刻加入 75%乙醇浸没海绵 样品并超过 2 cm 以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外样品保存箱，用于分子生物学鉴定。 4.3 上述样品均可在 4 条件下保存 1 天。 4.4 海绵样品采集与保存记录于海绵资源调查采样表（详见附录 A）。 5 海绵种属鉴定方法海绵种属鉴定方法 以海绵的COI基因序列为鉴定海绵种属的分子生物学信息。 5.1 海绵海绵 DNA 提取与纯化提取与纯化 5.1.1 取约 0.5 g 保存在乙醇中的海绵样品， 放入事先用液氮冷却过的研钵中， 加入液氮研磨海绵样品 成粉末状。 5.1.2 将研磨成粉末的海绵样品移入装有 600 L 细胞裂解缓冲液的聚丙烯离心管中混匀，加入 3 L 蛋白酶 K，在 55水浴锅上放置 3h 以上。 5.1.3 从水浴锅取下装有海绵的离心管，放置室温后，加入 200 L 醋酸钾溶液，振荡、混匀。 5.1.4 在 4离心（12,000 rpm）3min,将上清液转移至装有 600 L 异丙醇的新的聚丙烯离心管中， 振荡、混匀，然后在室温离心（12,000 rpm）3min。 5.1.5 吸去上清液，加入 600 L 乙醇（70%），振荡混匀，在室温离心（12,000 rpm）3min（重复此 过程一次）。 5.1.6 吸去上清液，在空气中干燥 DNA 沉淀 15 min；将 DNA 沉淀溶解于 300 L TE 缓冲液（pH 7.6）， 作为海绵基因组 DNA 提取纯化液。 5.1.7 海绵基因组 DNA 提取纯化液保存于- 80。 5.2 海绵海绵 COI 基因序列片段的基因序列片段的 PCR 扩增与测序扩增与测序 DB 21/T 22092013 3 5.2.1 使用扩增海绵 COI 基因序列片段的特异引物对（LCO1490: GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G；COX1- R1: TGT TGR GGG AAA AAR GTT AAA TT）。 5.2.2 在 100 L PCR 反映管中加入如下试剂：10PCR 缓冲液 10 L、引物 LCO1490（20 pmol/L）0.5 L、引物 COX1- R1（20pmol/L）0.5 L、海绵基因组 DNA 提取纯化液 10L、Taq 酶(5U/L) 0.5 L、 超纯水定容至 50 L。 5.2.3 把此 PCR 反应管放在普通 PCR 仪中， 并按照如下条件在进行 PCR 扩增海绵 COI 基因序列片段 的反应：一个循环反应（94 2min、50 1min、72 2min），30 个循环反应（94 50 秒、50 50 秒、72 2min），最后在 72停留 10min，结束 PCR 反应。 5.2.4 从 PCR 仪中取出扩增的海绵基因片段产品，经测序后获得海绵 COI 基因片段 DNA 序列信息。 5.3 海绵分子生物学种属鉴定海绵分子生物学种属鉴定 5.3.1 新测序的海绵 COI 基因 DNA 片段序列在在线网站（/）进行核苷酸 （nucleotide）序列比对，初步获知海绵种属信息； 5.3.2 根据初步获得的海绵种属信息，根据国际公认的已鉴定海绵 COI 基因 DNA 片段序列信息（在 线网站：/）确认海绵种属，COI 基因 DNA 片段序列一致性不低于 99% 的海绵被鉴定为同一种属海绵，记下种属名，记录于海绵分子生物学鉴定记录表（详见附录 B）。 5.3.3 对于海绵 COI 基因 DNA 片段序列一致性低于 99%的海绵， 作为暂时不能鉴定海绵， 记录于 暂 时不能鉴定海绵的记录表（详见附录 C）。 A DB 21/T 22092013 4 A B 附 录 A （资料性附录） 海绵资源调查采样表 海区 船名 航次 ； 采样点经度 纬度 ； 采样时间 年 月 日 时 分 至 年 月 日 时 分 采样人 ； 水深 水温 盐度 ； 序号 标本瓶号 海绵样品记录名称 数量 备注 1 2 3 4 5 6 7 记事： 采样 记录 校对 DB 21/T 22092013 5 B C 附 录 B （资料性附录） 海绵分子生物学鉴定记录表 鉴定人 ；地点 ； 时间 年 月 日 时 分 至 年 月 日 时 分 分子生物学仪器的名称 型号 ； 序号 标本瓶号 海绵样品记录名称 海绵分子生物学鉴定结果