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第二军医大学硕士学位论文sparcl1在胃癌中的表达及其对预后的影响姓名：李萍申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：王杰军2011-05 sparcl1 在胃癌中的表达及其 对预后的影响 摘 要 在胃癌中的表达及其 对预后的影响 摘 要 目的目的 sparcl1，也称为 hevin, mast9, sparc 家族成员之一，是一种细胞外基 质糖蛋白，参与细胞的增殖、分化等多种生理功能，在内皮细胞的粘附和转运等过程中起着重要的生物学作用。hevin 最初是从人扁桃体淋巴组织的高内皮静脉中（high endothelial venules）分离出来的。高内皮微静脉是淋巴组织中的一些特殊的圆形的毛细血管后微静脉，与普通血管中扁平的内皮细胞不同，有利于血液中高水平的淋巴细胞进入淋巴系统。以往有关该基因的研究局限于基因结构方面；近年对该基因的研究逐步扩展到神经系统和包括前列腺癌、非小细胞肺癌、肝癌等在内的实体瘤中。相关研究表明 sparcl1 在绝大多数肿瘤中表达下调，起着肿瘤抑制作用，但在肝癌和子宫肌瘤中的研究发现时高表达的。因此目前有关该基因的研究尚存在一定的争议，其在肿瘤中的作用机制尚不十分清楚。本课题旨在探索 sparcl1 蛋白在胃癌组织中的表达情况及其与临床病理参数和预后之间的关系。 方法方法 利用组织芯片技术构建包含 1,072 例胃癌患者的大样本组织芯片（含胃癌组织和癌旁正常组织） 。利用 real-time 定量 pcr、半定量 pcr、免疫组化（ihc） 、免疫印迹等实验技术分别从 mrna 水平和蛋白水平来检测 sparcl1 mrna 和sparcl1 蛋白的表达情况，比较其与临床病理参数以及与胃癌患者预后之间的关系。并同时通过 pcr-sscp 的方法检测 10 对胃癌组织和正常组织中不同sparcl1 基因位点（sparcl1，d4s2929，d4s2462）的杂合性缺失情况。 计数数据采用2检验方法，单因素的比较采用 t 检验。单因素生存分析采用 kaplanmeier 生存分析法，多因素生存分析采用 log-rank 生存分析法。统计分析和作图采用 microsoft office excel 2003 和 spss13.0 软件包。 p 0.05 认为具有统计学意义。 结果结果 1,072 例胃癌组织芯片的免疫组化结果提示， 413 例 （38.7%） 出现 sparcl1蛋白的低表达。qrt-pcr 和 rt-pcr 结果均显示，与正常组织相比，sparcl1 mrna 在癌组织中的表达明显下降。2检验表明 sparcl1 的表达与组织类型，肿瘤大小，浸润深度，淋巴结转移，tnm 分期以及分化明显相关，具有统计学意义。从 kaplanmeier 生存曲线可以看出 sparcl1 阳性患者生存时间长于sparcl1 阴性患者 (中位生存时间：59 月 v.s 28 月, p = 0.001). 我们的研究结果表明胃癌患者中，sparcl1 低表达的五年生存率(37.8%)明显低于高表达者(49.7%) (p 0.001)。多因素生存分析提示 sparcl1 在高中分化、无远处转移的胃腺癌患者中可能作为一个独立的预后因素而存在。 各位点的杂合性缺失情况如下：d4s2462，12.5% (1/8)；d4s2929，20% (2/10)；sparcl1，33.3% (3/9)。 结论结论 本研究揭示了 sparcl1 蛋白在胃癌组织中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系。sparcl1 表达水平的下调，提示它可能在胃癌发生发展中作为一种阴性事件而存在，影响着胃癌患者的预后。同时，本实验首先对 sparcl1 的低表达的机制进行了初步的探讨， 为该基因在肿瘤发生发展中的研究提供了一定的基础，也为胃癌个体化治疗和临床研究提供了可能的分子靶标。 关键词关键词 胃癌；sparcl1；杂合性缺失；预后 the expression of sparcl1 in human gastric cancer and its effect on prognosis abstract objective sparc-like protein 1(sparcl1), a member of extracellular matrix glycoprotein, also know as hevin, mast9, is involved in many physiological functions, such as cellular proliferation and differentiation. it also plays an important role in endothelial cell adhesion and transendothelial migration. hevin was initially isolated from high endothelial cells of tonsillar venules. in contrast with the endothelial cells from other vessels, the high endothelial cells of hev have a plump, almost cuboidal appearance and are able to support high levels of lymphocyte extravasion. in the past years, research about sparcl1 was limited to its structure, while recently related study has extended to neural system and solid tumors, such as prostate cancer, non-small cell lung cancer, and hepatic carcinoma. sparcl1 was found to be down-regulated in most cancers and functioned as inhibition in tumor formation and progression. however, it was overexpressed in hepatic carcinoma and human uterine leiomyoma. so data concerning it in cancer have been controversial. in addition, its role in gastric cancer is still unknown. the aim of this study was to analyze sparcl1 expression in normal and tumor tissues, to study its clinical and prognostic significance in the large samples of chinese gastric cancer, and further to examine the potential mechanism for the downregulation of sparcl1. methods tissue microarray blocks were constructed based on 1,072 chinese patients, containing both gastric cancer tissues and adjacent normal mucosa tissues. we analyzed the expression of sparcl1 from both mrna and protein level, using real-time quantitative polymerase chain reaction (qrt-pcr), semi-quantitative pcr, and immunohistochemistry (ihc). loss of heterozygosity analysis at the sparcl1 gene locus was carried out using ten paired tumor and matched normal tissues. three different microsatellite markers were used (d4s2462, d4s2929 and sparcl1). different sparcl1 mrna expression in tumor tissues and matched normal tissues were analyzed using the students t test, and the relationship between sparcl1 expression and clinicopathological parameters were analyzed using chi-square test or fishers exact test (if necessary). overall survival curves were evaluated through kaplanmeier method and the log-rank test was used to estimate survival rate differences. the cox proportional hazards regression model for multivariate survival analysis was applied to assess the prognostic value of different clinicopathological parameters. two-sided probability value less than 0.05 was considered to be statistically significant. all statistical analysis was done using the spss 13.0 software (spss inc., chicago, il). results immunohistochemistry (ihc) staining shows that low expression of sparcl1 protein was detected in 413 cases among the total 1,072 gastric cancer patients (38.7%). parallel to our tissue microarray data, sparcl1 mrna was found to be significantly down regulated in tumor compared with normal tissue through real-time quantitative polymerase chain reaction (qrt-pcr) and semi-quantitative pcr (rt-pcr). low expression of sparcl1 was significantly associated with histological type, tumor size, depth of invasion, regional lymph node, tnm stage, and differentiation. we learned that low expression of sparcl1 was associated with poor prognosis. here we found that sparcl1-positive patients had median survival time of 59 months, whereas sparcl1-negative patients had median survival time of 28 months (p = 0.001). from our data, we found that 5-year survival rate (37.8%) in patients with reduced expression of sparcl1 was significantly lower than that of in patients with high expression (49.7%) (p 0.001). the incidence of loh for each individual marker was 12.5% (1/8) for d4s2462, 20% (2/10) for d4s2929 and 33.3% (3/9) for sparcl1, which might partly explain the reason that sparcl1 was reduced or loss in gastric cancer tissues. conclusion the present study reveals the relationship between sparcl1 expression and clinicopathological parameters in human gastric cancer. our study revealed the clinical significance of sparcl1 expression, providing a basis that the loss of sparcl1 is a negative event in gastric cancer progression and prognosis. meanwhile, our present study, for the first time provides evidence for low expression of sparcl1 and provides a possible molecular target for individual treatment and clinical research in gastric cancer. key words gastric cancer; sparcl1；loss of heterozygosity；prognosis 缩略词表缩略词表缩略词表缩略词表sparcsparcsparcsparcsecreted protein acidic and rich incysteine富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白sparcl1sparcl1sparcl1sparcl1sparc-like protein 1sparc 类似蛋白 1hevinhevinhevinhevinhigh endothelial venule protein高内皮静脉蛋白mastmastmastmastmagnet-assisted subtraction technique磁铁辅助减影技术ihcihcihcihcimmunohistochemistry免疫组织化学lohlohlohlohloss of heterozygosity杂合性缺失pcrpcrpcrpcrpolymerase chain reaction聚合酶链反应rt-pcrrt-pcrrt-pcrrt-pcrreverse transcription pcr逆转录聚合酶链反应qrt-pcrqrt-pcrqrt-pcrqrt-pcrreal-time quantitative pcr荧光定量聚合酶链反应pcr-sscppcr-sscppcr-sscppcr-sscppcr single strand conformationalpolymorphism聚合酶链反应单链构象多态性tmatmatmatmatissue microassay组织芯片pbspbspbspbsphosphate buffer saline磷酸盐缓冲液dabdabdabdab3-3diaminobenzidine3-3二氨基联苯胺spspspspstreptavidin-peroxidase链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 1 - 前 言 前 言 胃癌作为常见的恶性肿瘤之一，是一个世界性的健康负担。2008年全世界胃癌新发病例约100万人, 成为世界第四位最常见的恶性肿瘤，仅次于肺癌，乳腺癌和结直肠癌。发展中国家所占比例超过70%，约一半发生在东亚（其中我国新发病例约46万）。同年，全世界约73万人死于胃癌，其中我国死亡人数约为35万。从国际癌症研究机构（iarc）2008年的统计数据来看，我国胃癌发病率高，死亡率高，严重危害着人类的健康。即使根治性手术或者辅助化疗后，仍有将近60%的病人出现胃癌的复发或者转移，同时影响着胃癌患者的预后1。尽管在过去的几十年中，胃癌的研究取得了很大的进展，但是仍然没有足够的证据显示胃癌发生发展的临床生物学方面的内在分子机制1。对致细胞癌变的调控基因的认识，如癌基因，抑癌基因和dna修复基因，是癌症研究的主要目标之一，为肿瘤的治疗带来了新的靶点并在一定程度上改善了预后。研究表明，这些基因在肿瘤组织和正常组织中的表达差异显著， 提示相关基因的过度表达或者低表达可能与肿瘤的发生发展密切相关2。肿瘤的发生是一个多基因参与、多步骤的复杂过程。近年来，随着细胞分子生物学技术的成熟和完善，使癌基因和抑癌基因等相关基因的研究得以快速发展；随着认识的不断深入，使人们有可能对某些常见人体肿瘤的发生发展过程作出基因水平的解释，从而对其易感性预测、预防、治疗设计和预后等方面提出更为合理的方案。 进一步研究并阐明癌基因和抑癌基因等相关基因对细胞分裂分化过程中的调控和癌变机理，对肿瘤的治疗，特别是肿瘤基因治疗将具有十分重要的价值。 sparc类似蛋白1（sparc-like protein 1, sparcl1）是细胞基质蛋白中sparc相关家族成员之一。sparc家族包括十个成员，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（sparc），也被称为骨连接素（osteonectin）和bm40，以及sparc类似蛋白1（sparcl1），也称为高内皮静脉蛋白（high endothelial venule protein, hevin）和mast9, 均属于该家族中的成员并且被认为在多种肿瘤的发生发展中起着极其重要的作用3。 sparcl1/hevin基因最初是从高内皮静脉中克隆出来的，有助于淋巴细胞通过内皮细胞粘附的方式穿出血管。sparcl1在很多组织中表第二军医大学硕士学位论文 - 2 - 达，比如淋巴结，脑，心脏，肺脏3。早期的研究表明sparcl1可能在肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用2, 4。最近发现，该基因在前列腺癌5和非小细胞肺癌6中发生低表达， 提示sparcl1可能参与了这些肿瘤的病理形成过程。 但是，其在人类肿瘤中的作用尚不是十分清楚。sparcl1具有一定的抗粘附能力，它的缺失或者低表达，与细胞增殖能力的增加和细胞周期进程密切相关。缺失或低表达的原因可能为突变、 杂合性缺失或者启动子甲基化等3。 sparcl1参与了生物体的许多细胞活动，其在肿瘤方面的研究尚且存在一定的争议9。而且，sparcl1在胃癌发生发展及预后中的作用至今尚未见报道。因此，结合我国胃癌高发的基本国情，我们利用所构建的组织芯片进行免疫组化等实验，检测sparcl蛋白在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达是否存在差异，并进一步去探讨该蛋白的表达差异是否会影响到胃癌患者预后及其出现差异的可能的分子机制。 本研究包括两部分：（1）利用已经构建的胃癌组织芯片采用免疫组织化学的方法从蛋白水平检测sparcl1蛋白在胃癌组织和相应癌旁组织中的分布及表达情况； 采用rt-pcr和qrt-pcr的方法从rna水平进一步验证sparcl1 mrna在胃癌组织和相应癌旁正常组织中的表达情况；探讨胃癌组织中sparcl1蛋白的表达与临床病理参数之间的关系；探讨sparcl1蛋白的表达与胃癌患者预后的关系； （2） 应用pcr-sscp的方法探讨sparcl1蛋白发生杂合性缺失（loh）的情况，揭示其低表达可能存在的分子机制。 sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 3 - 第一部分 第一部分 sparcl1在胃癌中的表达情况及其与预后的相关性研究 在胃癌中的表达情况及其与预后的相关性研究 肿瘤的发生是一个多步骤、多基因、序贯的复杂过程，涉及到多种基因及其产物的异常变化和相互作用。 肿瘤的发生是癌基因激活和抑癌基因失活导致细胞生长调控异常和过度增生的结果。胃癌是世界尤其是我国的多发肿瘤之一，然而其发生发展的相关分子机制还不清楚。 这部分研究主要利用已经成功构建的组织芯片通过免疫组织化学的方法以及rt-pcr和qrt-pcr的方法分别从蛋白水平和rna水平检测sparcl1蛋白在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况，分析其与临床病理参数之间的关系，并进一步探讨其与胃癌患者预后的相关性。 一 材料和方法 （一） 实验材料 （一） 实验材料 1 组织标本 1 组织标本 收集2001-2005年存档的石蜡标本，21张组织芯片已经成功构建好，包括1,072例原发肿瘤及其配对癌旁正常粘膜组织，病理诊断结果经两名以上病理医师确认。其中男性757例，女性315例，中位年龄59岁。 2 主要试剂 2 主要试剂 rna 抽提试剂盒 trizol 购自上海生工； 逆转录试剂盒购自日本 takara 公司； premix taq 酶购自日本 takara 公司； sybr premix ex taq 试剂盒购自日本 takara 公司； 引物设计由上海生工完成； 羊抗人 sparc-like 1 多克隆抗体（af2728）购于美国 r&d systems 公司，工作浓度为 1:400； 第二军医大学硕士学位论文 - 4 - 超敏 sp 免疫组化试剂盒（羊）购自中国福建迈新生物技术公司； pbs 磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐抗原修复液、苏木素染色液和 dab 显色试剂盒均购自福建迈新生物技术公司。 3 主要仪器设备 3 主要仪器设备 dt-102a 型电子天平（江苏常熟金羊天平仪器厂） fa1104 型上皿电子天秤（上海精科天平厂） tgl-16b型台式高速离心机（上海医用分析仪器厂） biofuge22r型高速低温离心机（heraeus） yj-sd型医用净化工作台（苏州蓝林净化空调设备制造有限公司） s648型电热恒温水温箱（上海医疗器械厂） cx31rbsf型显微镜（olympus） 生物医学专用微波炉（galanz） sds电泳仪、western blot电转移系统（bio-rad公司） bcd-206f型电冰箱（河南新飞电器有限公司） mdf-u32v型超低温冰箱（sanyo，japan） biometra型普通pcr扩增仪（germany） abi prism 7300型荧光定量pcr扩增仪(applied bio-systems) （二）实验方法 （二）实验方法 1 逆转录聚合酶链反应（ 逆转录聚合酶链反应（rt-pcr） ） （1）组织总（1）组织总rna的提取 的提取 预冷研钵，在液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5-ml离心管中。每100mg组织加1ml的trizol； 用1ml针筒，26-g号（4.5）针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组dna，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml eppendorf管中； 加入100l氯仿/异戊醇（24:1），剧烈震荡混匀30秒； 台式离心机上，12,000 rpm，室温离心5分钟； 将上清液（约450l）小心转移到无菌1.5ml rnase-free离心管中，加入150l无水乙醇，混匀； 将上述溶液全部转移到套放于2ml收集管内的uniq-10柱中，室温放置2分sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 5 - 钟，8,000 rpm离心1分钟； 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450l rpe solution，10,000 rpm，室温离心30秒； 重复步骤7一次； 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10,000 rpm，室温离心15秒； 小心取出柱子， 放入无菌 rnase-free 的 1.5ml离心管里， 在柱内膜的中央小心加入50l depc-h2o,5580放置2分钟； 10,000rpm，室温离心1分钟。收集管内的溶液为rna样品，可立即使用或者-80保存； （2）（2）rna质量检测 质量检测 紫外吸收法测定rna的浓度及纯度： 测定样品在260nm 和280nm 的吸收值确定rna的质量。按1od260=40g rna 计算rna的产率； od260/280在1.8-2.0视为抽提的rna纯度很高； 进行琼脂糖凝胶电泳，确定抽提rna的完整性和dna的污染情况： 配胶；上样；电泳； 紫外灯下观察并拍照：28s和18s核糖体rna的条带非常亮而弄浓，28s条带的密度大约是18s条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的条带，它是由低分子量的rna（trna和5s核糖体rna）组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna条带的上方出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。 （3）逆转录反应体系及反应条件 （3）逆转录反应体系及反应条件 pcr反应引物 各引物情况详见表 1。 第二军医大学硕士学位论文 - 6 - 表 1 目的基因sparcl1和内参-actin的引物情况 table 1. the primer sequences of sparcl1 and -actin gene primer sequences sparcl1 -actin forward primer：caactgctgaaacggtagca reverse primer：gaactcttgccctgttctgc forward primer：gctgtcaccttcaccgttc reverse primer：ccatcgtccaccgcaaat 反应体系（冰上操作） 试剂 使用量 终浓度 5primescripttm buffer 4l 1 primescripttm rt enzyme mixi 1l oligo dt primer 1l 25pmol random 6 mers 1l 50pmol total rna xl rnase free dh2o up to 20l 注：20l反应体系中最大使用1g的total rna,所以rna体积均按照最大使用量计算。 反应条件 37 15min（反转录反应） 85 5sec （反转录酶的失活反应） 4 10min 注：所得到的 cdna 可立即使用或者-80保存； （4）聚合酶链反应（pcr）扩增反应体系及反应条件 （4）聚合酶链反应（pcr）扩增反应体系及反应条件 反应体系（冰上操作） 试剂 使用量 premix taq 12.5l 模板dna 2l 上游引物f 0.5l 下游引物r 0.5l sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 7 - rnase free dh2o up to 25l 反应条件 94 预变性 30s 94 变性 1min 58 退火 30s 30 个循环 72 延伸 1min 72 再延伸 10min 4 保存 注：-actin 作为内参，退火温度为52。 2 实时定量聚合酶链反应（实时定量聚合酶链反应（qrt-pcr） （1）rna 的提取和逆转录反应同前述；的提取和逆转录反应同前述； （2）实时定量聚合酶链反应（）实时定量聚合酶链反应（qrt-pcr）扩增反应体系和反应条件）扩增反应体系和反应条件 荧光定量pcr反应引物 各引物情况详见表 2。 表 2 目的基因sparcl1和内参gapdh的引物情况 table 2. the primer sequences of sparcl1 and gapdh gene primer sequences sparcl1 gapdh forward primer：caactgctgaaacggtagca reverse primer：gaactcttgccctgttctgc forward primer： atcctgggctacactgagcaccareverse primer：aagtggtcgttgagggcaatgcc 反应体系（冰上操作） 试剂 使用量 sybr premix ex taq 12.5l 上游引物f 0.5l 下游引物r 0.5l 第二军医大学硕士学位论文 - 8 - 模板dna 0.2l rnase free dh2o up to 25l 反应条件 stage 1：预变性 95 1min repeat: 1 stage 2：pcr 反应 repeat: 40 95 15s 60 31s 3 免疫组织化学（免疫组织化学（ihc） 组织切片常规脱蜡和水化后，pbs冲洗3次，每次3分钟； 在柠檬酸盐抗原修复溶液（按照1:100的比例稀释配制）中给予微波抗原修复3min20s，自然冷却后，pbs冲洗3次，每次3分钟； 每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻断溶液（试剂a） ，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。pbs冲洗3次，每次3分钟； 除去pbs液，每张切片加1滴或50l正常非免疫动物血清（试剂b） ，室温下孵育10分钟； 除去多余血清，不洗，每张切片加1滴或50l的sparcl1抗体（一抗） ，4过夜。 pbs冲洗3次，每次3分钟； 除去pbs液，每张切片加1滴或50l生物素标记的第二抗体（试剂c） ，室温下孵育10分钟。pbs冲洗3次，每次3分钟； 除去pbs液，每张切片加1滴或50l链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂d） ，室温下孵育10分钟。pbs冲洗3次，每次3分钟； 除去pbs液，每张切片加2滴或100l新鲜配制的dab溶液，显微镜下观察3-10分钟； 自来水冲洗，苏木素复染，pbs或者自来水冲洗返蓝； 中性树胶封片；镜下观察。 注：以pbs代替一抗作为空白对照； 结果判定采用二级计分法判断，根据阳性sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 9 - 细胞所占5个以上高倍镜视野比例计数分为4类：5%-25%计1分，26%-50%计2分，51%-75%计3分，75%计4分；染色强度分类：淡黄色计1分，黄或深黄色计2分，褐或棕褐色为3分，两者计分相乘大于1为阳性。 （三）（三） 统计学分析统计学分析 计量资料采用t检验； 计数资料采用2检验或者fisher确切概率法； 单因素生存分析采用kaplanmeier法和log-rank检验；多因素生存分析采用cox比例风险回归模型分析。p0.05表示差异有统计学意义。所以数据统计分析和作图均使用microsoft office excel 2003 和 spss 13.0 软件包（spss inc.,chicago,il） 。 二 实验结果 二 实验结果 （一）（一） 逆转录聚合酶链反应结果分析逆转录聚合酶链反应结果分析 1 琼脂糖凝胶电泳验证所提取琼脂糖凝胶电泳验证所提取rna的完整性的完整性 从图 1 可以看出，所提取的总rna较完整。总rna的琼脂糖凝胶电泳显示28s rrna和18s rrna 条带非常亮且浓，而且28s rrna条带的亮度差不多是18s rrna条带亮度的两倍，5s rrna条带隐约可见。 图 1. 总rna的琼脂糖凝胶电泳图 figure 1. total rna by electrophoresis on 1.5% agarose gel 2 普通普通pcr检测检测sparcl1 mrna 在胃癌组织和相应癌旁组织中的在胃癌组织和相应癌旁组织中的28s rrna 5s rrna 18s rrna 第二军医大学硕士学位论文 - 10 - 表达表达 琼脂糖凝胶电泳(1.5%)显示了sparcl1 mrna 在胃癌组织 (t) 和相应癌旁组织 (n)的表达情况(图 2)。#1, #2, #3 和 #4分布代表了不同的组织。sparcl1 mrna 的条带大小为184bp，-actin 作为内参，其条带大小为194bp。凝胶的第一个泳道是marker的条带(dna marker dl 2000)，从下至上分别代表100bp, 250bp, 500bp。通过quantity-one 图像处理软件比较分析胃癌组织（t）与癌旁组织（n）中 sparcl1 mrna 的表达情况，p 0.001 提示两组之间存在统计学差异。 m t n t n t n t n #1 #2 #3 #4 图 2. sparcl1 mrna在胃癌组织及其相应癌旁组织中的表达 figure 2. sparcl1 mrna expression in gastric cancer tissue (t) and corresponding normal tissue (n) （二）（二） 荧光定量聚合酶链反应结果分析荧光定量聚合酶链反应结果分析 1 荧光定量荧光定量pcr的溶解曲线结果的溶解曲线结果 sparcl1 荧光定量pcr溶解曲线显示为单峰，表明pcr产物为特异性扩增（图 3） 。 sparcl1 -actin 184bp 194bp 500bp 250bp 100bp sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 11 - 图 3. sparcl1 qrt-pcr 溶解曲线。 figure 3. melt curve of sparcl1 qrt-pcr. 2 实时定量实时定量pcr检测检测sparcl1 mrna在胃癌组织及其相应癌旁组织中的表达情况在胃癌组织及其相应癌旁组织中的表达情况 图4横坐标中的阿拉伯数字表示7对不同的组织。纵坐标显示sparcl1 mrna 在不同组织中的相对值。灰色条形图代表的是胃癌组织(t)，黑色的条形图代表的是相应的癌旁组织(n)。与癌旁组织相比，sparcl1 mrna 在肿瘤组织中的表达明显下降，差异具有统计学意义（p 0.001） 。 00.511.521234567tn 图 4. 荧光定量pcr检测sparcl1 mrna在胃癌组织及其相应癌旁组织中的表达 第二军医大学硕士学位论文 - 12 - figure 4. sparcl1 mrna expressions in gastric cancer tissues and the corresponding adjacent normal tissues by qrt-pcr. 3 免疫组织化学染色结果分析免疫组织化学染色结果分析 对包含1， 072例病例的所有21张组织芯片采用sp法对胃癌组织和相应癌旁组织进行免疫组织化学染色。染色结果表明，sparcl1蛋白在组织中的表达定位于细胞浆。在正常胃黏膜组织中几乎均有表达（(956/1072)） ，且绝大多数表现为强阳性。1,072例胃癌组织中sparcl1蛋白低表达的比例为38.7%（413/1,072）。a. sparcl1蛋白在正常胃黏膜中为阳性表达；b. sparcl1蛋白在高分化胃癌组织中表现为阳性表达； c. sparcl1蛋白在中分化胃癌组织中也表现为阳性表达；d. sparcl1 在低/未分化胃癌组织中表现为阴性表达。 (见图5， 放大倍数: 400 ) a正常胃黏膜组织中sparcl1 b. 高分化胃癌组织中sparcl1的 的阳性表达 阳性表达 athe positive expression of sparcl1 b. the positive expression of sparcl1 in normal tissue in well differentiated gastric cancer tissue sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 13 - d低/未分化胃癌组织中sparcl1 c. 中分化胃癌组织中sparcl1的 的阴性表达 阳性表达 d. the negative expression of sparcl1 c. the positive expression of sparcl1 poorly differentiated and undifferentiated moderately differentiated gastric cancer tissue tissue 图5. 免疫组化染色法检测sparcl1蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达 figure 5. immunostaing of sparcl1 protein in gastric cancer tissues and matched normal tissues. 4 胃癌组织中胃癌组织中sparcl1蛋白表达情况与患者临床病理参数之间的关系蛋白表达情况与患者临床病理参数之间的关系 对胃癌组织中sparcl1蛋白表达情况与患者临床病理参数之间的关系进行2检验，结果表明，sparcl1 的低表达与胃癌组织类型，肿瘤大小，浸润深度，淋巴结转移，tnm分期以及分化程度明显相关。然而，在原发肿瘤部位和远处转移方面却没有发现具有明显的相关性（见表 3）。 表 3. 胃癌组织中sparcl1蛋白表达与患者临床病理参数之间的关系 table 3. relationship between sparcl1 protein expression and clinicopathological parameters in gastric cancer. 第二军医大学硕士学位论文 - 14 - clinicopathological factors sparcl1 expression negative positive p value histological type adenocarcinoma mucinous adenocarcinoma signet ring cell carcinoma other 343(36.2%) 0(0%) 3(75.0%) 69(59.5%) 604(63.8%) 5(100%) 1(25.0%) 47(40.5%) 0.001 primary tumor location cardia and fundus corpus antrum whole 60(33.3%) 129(39.2%) 208(40.1%) 18(40.9%) 120(66.7%) 200(60.8%) 311(59.9%) 21(59.1%) 0.436 size 3 cm 3-6 cm 6 cm 115(33.4%) 185(38.5%) 115(46.6%) 229(66.6%) 296(61.5%) 132(53.4%) 0.005 invasion depth t1 t2 t3 t4 29(19.2%) 62(38.5%) 283(42.6%) 41(42.7%) 122(80.8%) 99(61.5%) 381(57.4%) 55(57.3%) 0.001 regional lymph node n0 n1-3 111(31.2%) 304(42.5%) 245(68.8%) 412(57.5%) 0.001 distant metastasis no yes 390(38.5%) 25(43.1%) 624(61.5%) 33(56.9%) 0.480 tnm stage i ii iii iv 56(25.8%) 76(36.2%) 205(43.7%) 78(44.3%) 161(74.2%) 134(63.8%) 264(56.3%) 98(55.7%) 0.001 sparcl1 在胃癌中的表达及其对预后的影响 - 15 - differentiation well/moderately poorly/undifferentiation 188(29.9%) 227(51.1%) 440(70.1%) 217(48.9%) 0.001 total 415(38.7%) 657(61.3%) 5 sparcl1 蛋白的表达情况与胃癌患者预后之间的关系蛋白的表达情况与胃癌患者预后之间的关系 单因素生存分析表明胃癌组织中 sparcl1 阳性表达的患者预后好于sparcl1 阴性表达的患者（见图 6-a），中位生存时间分别为 59 months v.s 28months, p = 0.001。进一步对患者以分化程度进行亚组分析发现，高/中分化胃癌组织中，sparcl1 阳性表达的患者预后明显优于 sparcl1 阴性的患者（见图 6-b），中位生存时间分别为 69 months v.s 45 months, p = 0.008。但是，在低/未分化胃癌组织中，未发现患者的预后有明显的统计学差异（见图 6-c）。多因素生存分析发现，肿瘤大小，浸润深度，淋巴结转移和分化程度均为胃癌患者的独立预后因素，然而，sparcl1 并非作为独立的预后因素而存在（表 4）。 图 6-a. 胃癌患者的 kaplan-meier 生存曲线 figure 6-a. kaplan-meier survival curves of gastric cancer patients. 120.00100.0080.0060.0040.0020.000.00months after surgerymonths after surgery1.00.90.80.70.60.50.40.3overall s urvivaloverall s urvivalpositivenegativepositivenegativep = 0.001p = 0.001第二军医大学硕士学位论文 - 16 - 图 6-b. 高/中分化胃癌患者的 kaplan-meier 生存曲线 figure 6-b. kaplan-meier survival curves of well and moderately differentiation gastric cancer patients. 图 6-c. 低/未分化胃癌患者的 kaplan-meier 生存曲线 figure 6-c. kaplan-meier survival curves of poorly differentiated and undifferentiated gastric cancer patients. 120