医学综述论文：肌肉生长抑制素基因的研究进展

1 / 12 医学综述论文：肌肉生长抑制素基因的研究进展 摘 要：肌肉生长抑制素又称 GDF-8,属 TGF- 超家族 ,是骨骼肌生长的负调控因子。最早在小鼠中发现该基因的突变可导致骨骼肌肥大。随后的研究表明，肉牛的双肌现象也是该因子外显子 3 11bp 的碱基缺失或保守的单个碱基的突变所造成的。对人肌肉生长抑制素基因的研究表明，它包括 3 个外显子和 2个内含子，在人的骨骼肌中特异性地表达，产物为成熟糖蛋白。目前，该基因已分别在人、牛和猪的染色体上定位。猪的肌肉生长抑制素基因的表达在仔猪出生时显著下降，而且其表达在生后仔猪的乳腺中 也可检测到。 关键词： 肌肉生长抑制素； TGF- 超家族；双肌 中图分类号： Q956 文献标识码： A 文章编号： 0253 9772(2000)02 0119 03 Myostatin:A Negative Regulator of Skeletal Muscle Mass JIANG Yun-liang （ College of Animal Science Technology,Shandong Agricultural University,Taian 271018） LIAN Zheng-xing LI Ning （ National Laboratory for Agro-Biotechnology,China 2 / 12 Agricultural University,Beijing 100094） WU Chang-xin （ College of Animal Science Technology,China Agricultural University,Beijing 100094） Abstract： Myostatin, a member of the transforming growth factor-superfamily,is a genetic determinant of skeletal muscle growth.Mice and cattle with loss of function mutation of this gene have marked muscle hypertrophy.Myostatin is mapped to 2q33.2 in human,2q11or 2q14 15 in cattle and 15q2.3 in pig.The genomic structure of human myostatin gene contains 3 exons and 2 introns,with the whole length of about 7.7kb.Myostatin is expressed uniquely in the human skeletal muscle as a 26 kDa mature glycoprotein and secreted into the plasma. In Texel “double -muscle” sheep,no missense mutations were detected,but by linkage analysis a QTL flanking myostatin was associated with this trait.In porcine tissues,1.5 and 0.8kb transcripts were detected by Northern blot，myostatin peaks prenatally and its higher expression is associated with low birth weight. Key words： myostatin； transforming growth factor-; 3 / 12 double muscle 肌肉生长抑制素又称 GDF-8（ growth differentiation factor 8），属 TGF-(transforming growth factor beta,转化生长因子 )超家族。这是一类分泌型的多肽，在细胞间的通讯中起介导作用。它可以改变成纤维细胞的表型，抑制细胞的过度增殖，诱导软骨形成的分化以及具有免疫抑制作用等。该超家族中除了 TGF- 家族的成员以外，还包括Inhibin 家族、 DPP/VGI 家族以及 Mullerian Inhibiting Substance 家族等 1。第一个发现的成员为 TGF-1 是112 个氨基酸的多肽链通过二硫键形成的同二聚体 ,该链的前体是含有 390 个氨基酸残基的多肽，包括 :N-端疏水的信号肽序列，可籍以跨越内质网膜；前区的糖基化位点；紧 挨着生物活性区由 4 个氨基酸 (RSRR)组成的蛋白酶加工位点，以及 C-末端包含 9 个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体 2。 C 末端的 “ 半胱氨酸结 ” 结构在 TGFs- 和 Inhibin_ 家族中是保守的，而且其中至少有 7 个半胱氨酸在所有 TGF- 超家族中是保守的。 TGF-超家族的几乎所有成员（ TGF-4 除外 3）都具有相似的结构。 1 肌肉生长抑制素基因的发现、遗传效应及同源性分析 McPherron 等 4根据 TGF- 家族的保守区设计一4 / 12 对简并引物， PCR 扩增出一个约 280bp的新产物，以此为探针筛选小鼠的骨骼肌 cDNA文库，得到全长的 cDNA 序列；分析表明，该 cDNA中只有一个可读框（ opening reading frame，ORF），可编码 376 个氨基酸，它的结构具有 TGF- 超家族的典型特征，但又与 TGF- 家族其他成员的同源性很低（最高为 45），因而归为新的一类 GDF-8。该因子在第 9.5 p.c.(post-coitum) 小鼠胚胎中 ,1/3 的体节中表达 ,只限于最成熟的吻端部分； 10.5p.c.时在几乎所有的体节 (具体为生肌节区 )中都可检测到 ,此后在小鼠 胚胎发育的肌肉中均表达。成年以后该基因继续表达 ,几乎在所有的骨骼肌中都可检测到。通过基因敲除技术使小鼠的 GDF-8基因的 C端生物活性区缺失所得到的缺失突变纯合体小鼠，可以存活并能够生育，而且其体重比杂合体及野生型的小鼠重约 30（与性别及年龄无关）；肩、臀部的肌肉明显肥大，整个身体的骨骼肌都比野生型的小鼠大得多，单块肌肉的重量约为野生小鼠的 2 3 倍，从而导致了体重的增加。突变型小鼠骨骼肌肌纤维的数目比野生小鼠高出 86（ P2 牛的肌肉生长抑制素基因 肉牛的双肌现象历来受到人们的重视，选育得到了世界上有 名的 2个双肌牛品种 ,即比利时蓝牛（ Belgian blue）和皮尔蒙特牛（ Piedmontese）。目前已证实牛的双肌性状属于常染色体隐性遗传方式，由单个基因座（ mh， muscular 5 / 12 hypertrophy）控制，而且已定位于牛 2 号染色体的着丝粒端距离 TGLA44（微卫星标记， ms） 3.1cM。为了探讨 “ 双肌 ”牛肌肉发达的分子遗传机制， McPherron Lee 6 PCR扩增了牛肌肉生长抑制素基因的 3 个外显子，分析表明，比利时蓝双肌牛在外显子 3 缺失 11bp（ 937 947），造成了移码突变，使得从 缺失后面的第 14 个密码子开始停止翻译，其结果是 C-端仅 7 个氨基酸得到翻译，其余 102 个氨基酸（ 274 375）全部丢失，故此翻译出的是一个截断的蛋白，不能发挥其生物学功能； Southern 杂交分析表明，比利时蓝双肌牛为突变纯合子，在 14 头双肌牛中均可检出。在另一个双肌牛品种皮尔蒙特牛中，检出 2 个点突变，其中的一个是外显子 3的 1056 GA 突变，导致编码的氨基酸由保守的半胱氨酸突变为酪氨酸，结果肌肉生长抑制素的功能全部或几乎全部丧失； Southern杂交分析表明，该双肌牛在这个位点亦是纯合的。另一个突变在外 显子 1（ CA ），造成亮氨酸突变为苯丙氨酸。对非双肌牛肌肉生长抑制素基因的分析表明，未发现在皮尔蒙特牛中检出的突变，只在红安格斯牛中发现一例比利时蓝牛型突变的杂合子，表明肌肉生长抑制素基因突变是造成双肌的原因之一。另外，该基因在编码区的其他区段虽有突变，但或为沉默突变，或发生在内含子或非翻译区，不至于造成肌肉生长抑制素功能的重大丧失。从功能来看，该基因的突变只是造成牛肌肉中度增加（ 206 / 12 25）并使饲料转化率提高。不利的效应是母牛的生育力下降，犊牛的成活率降低以及性成熟延迟，还会使牛肉的肌间脂肪及结缔组织 减少，其他器官重量减轻等。与 McPherron Lee 6几乎同时， Grobet等 7和 Kambardur 等 8采用位置候选基因的方法报道了比利时蓝双肌牛肌肉生长抑制素基因同样的突变，确证了肌肉生长抑制素基因的突变是导致牛双肌的主要原因；并证明该基因与 mh 在染色体的同一区间。另外对来自 10个欧洲品种牛的 32头双肌牛肌肉生长抑制素基因编码区全序列的分析共鉴定出 7个 DNA多态性，其中的 5个为该基因的功能突变，但只有 2个品种的双肌牛对这些功能丧失突变为纯合的或复合杂合的；其余 2个变异中一个属保守的氨基酸 变异，一个属沉默的 DNA 序列变异；在内含子区鉴定了 4 个 DNA序列的多态性。由于在其他2 个品种中缺少这种失去功能的突变，推测在该基因的其它区段还存在其它类型的变异或归因于异质性 9。后来在意大利 Marchigiana 牛的 2个个体的肌肉生长抑制素基因外显子 3 中检测到 874GT 的突变，导致谷氨酸（ Glu）突变为终止密码子，使得 9 个保守的半胱氨酸中的 6个缺失 10。Poncelet等 11建立了能够表达牛肌肉生长抑制素融合蛋白的小鼠 CHO-K1 细胞系和体外验证的小鼠 C2C12 成纤维细胞系以及监测纯化的重组蛋 白生物活性的方法，以分析该因子的作用机制。 7 / 12 在牛肌肉生长抑制素基因的定位方面， Smith 等 12认为该基因靠近牛 2 号染色体的着丝粒处，位于 2q11，在包含mh 的区间内。 Sonstegard 等 13在牛 2 号染色体连锁图靠近 mh的位置又定位了着丝粒端的 7 个微卫星标记，并将 2个与肌肉生长抑制素基因相关的微卫星标记定位于牛 2号染色体连锁图 1.5cM 处。 Masabanda 等 14构建了包含肌肉生长抑制素基因的 2 号染色体的细胞遗传图谱，该基因定位于 2q14 15， COL5A2（ collagen， type -2 chain）以及 TFPI/LACI （ tissue factor pathway inhibitor/lipoprotein-associated coagulation inhibitor）也在该区域。 Pirottin 等 15建立了牛 2 号染色体着丝粒端高分辨的遗传图谱，建立了一个跨越肌肉生长抑制素基因的重叠群（ contig），覆盖约 1.2Mb，相距最远的 2 个标记距离为 7cM，分辨率为 160kb/cM。 3 人的肌肉生长抑制素基因 人肌肉生长抑制素基因的基因组结构已阐明 16：全长约 7.7kb，共包括 3 个外显子和 2 个内含子，内含子 1和内含子 2分别为 1.8和 2.4kb,三个外显子编码的氨基酸长度分别为： 125,124 和 126。从表达情况来看，成年人骨骼肌中可检测到 3.1kb 的 mRNA。引物延伸分析表明，该基因有3 个转录起始位点，分别位于 76， 116和 166。肌肉生8 / 12 长抑制素基因在骨骼肌中特异性地表达并分泌至血浆中，其表达产物是 26kDa 的成熟糖蛋白。在骨骼肌和血浆中均检测不到肌肉生长抑制素的前体。成人血清中肌肉生长抑制素的含量与去脂肪体重指数成反比（ r= 0.03,P=0.003）。 体重下降（消瘦）的艾滋病毒感染者，肌肉生长抑制素的浓度明显较高（ 499.7037.1 vs 290.512.9ng,P4 绵羊的肌肉生长抑制素基因 Marcq 等 17分析了比利时 Texel 双肌绵羊的遗传机制，与普通的绵羊（ Romanov）相比，双肌羊的肌肉生长抑制素基因的编码区没有碱基的差异；采用该基因侧翼的微卫星标记进行连锁分析（ F2 设计）表明，在绵羊染色体 2q远端区存在一个对肌肉的发育产生效应的 QTL，该基因座很可能就是肌肉生长抑制素基因。可以推断，影响该基因表达的区域很可能在 3 或 5 端的 非翻译区或内含子部分。 5 猪肌肉生长抑制素基因的研究现状 Sonstegard 等 18分析了猪肌肉生长抑制素基因外显子 2 的 DNA多态性和与之关联的微卫星标记，将该基因已定位于 15号染色体的 15q2.3。 Ji 等 19采用 Northern 杂交分析技术检测到 2 个转录子（ 1.5 和 0.8kb），从基因的表达来看，猪肌肉生长抑制素基因的 mRNA 在胎儿发育的第 21和 35天即可在整个胚胎中检测到，至第 49天时显著上升（ P作者简介：姜运良 (1967 )，男，山东平邑人， 在读博士，9 / 12 讲师，专业：动物分子遗传学。 姜运良（山东农业大学动物科技学院，泰安 271018） 连正兴（中国农业大学农业生物技术重点实验室，北京100094） 李宁（中国农业大学农业生物技术重点实验室，北京100094） 吴常信（中国农业大学动物科技学院，北京 100094） 参 考 文 献： 1 Massagu J. 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