探析苍术挥发油对成骨样细胞增殖的作用

1 / 6 探析苍术挥发油对成骨样细胞增殖的作用 摘要：目的研究苍术挥发油对成骨样细胞 UMR-106的增殖作用。方法苍术挥发油和 UMR 106 成骨样细胞体外共同培养 ,用 MTT 法检测细胞增殖。结果挥发油在 0.001 mg/ml 培养 48h 具有最强的促进细胞增殖作用。结论苍术挥发油中可能含有促进成骨细胞增殖的活性成分。 关键词： 苍术挥发油 增殖作用 成骨样细胞 UMR106 MTT 法 苍术（ Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术 Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等 1。 苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生苍术油软胶囊的研制。山东中医药大学硕士学位论文， 2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞 UMR-106的增殖作用。 1 材料与 方法 2 / 6 1.1 材料 苍术药材购自上海德康药业有限公司 ,经中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术 Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。 1.2 试剂 DMEM 培养基 (Cibco)； 3-(4,5-二甲基噻唑 -2)-2， 5-二苯基 -四唑氢溴酸盐 MTT(Sigma)；胎牛血清 FBS(杭州四季青生物工程材料研究所 )；胰蛋白酶 (Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。 1.3 方法 1.3.1 挥发油样品的制备水蒸气蒸 馏法：将药材样品粉碎过 40目筛，精确称取 200 g的苍术，加水浸泡 1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取 50 mg挥发油样品溶于 1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的 0.2 mm 滤器 ( Gelmann Sciences) 除菌 ,并于 4 保存，备用。临用时用 DMEM 培养液稀释至所需浓度。 1.3.2 成骨样细胞 UMR 106 的培养 3 UMR 106 (大鼠成骨肉瘤细胞系 ) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室 ,源于美国麻省医学院。将 UMR-106细胞培养于 103 / 6 胎牛血清（ 100KU/L 青霉素， 100 mg/ml链霉素）的无菌 DMEM培养基中，置 37,5%CO2 培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用 0.25胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为 5106 个 /ml 接种于100 ml 培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育， 2 3 d 换液 1次。 1.3.3 MTT 法测定细胞的增殖 2取对数生长期细胞消化计数后 ,用含血清的 DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1105 个 /ml ,铺入 96 孔细胞培养板中 (100 l/ 孔 )培养24 h后加入含不同浓度挥发油 (每个浓度 6孔 )的无血清 DMEM培养。结束培养 4 h 前弃去培养液 ,每孔加入 20 l MTT(5 mg/ml,用 PBS配制 )继续孵育 4 h,有蓝紫色沉淀生成 ,每孔加入 150 l 二甲基亚砜 (DMSO) ,振荡 10 min 待沉淀完全溶解 ,用酶标仪以 550 nm 为测定波长、 650 nm 为参比波长测定吸光值 ,以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白 ,用 t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下： 增殖率（ %） = Ai实验组 - Ao 对照组 Ao对照组 100% Ai：不同条件下的吸光值； Ao：空白组的吸光值 4 / 6 2 结果 2.1 MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将 UMR-106细胞分别以 6个不同浓度 (1105 1.2106 个 )铺入 96 孔板 ,培养 8 h贴壁后 ,用上述方法测定每孔吸光度 (Y),与细胞数目 (X)作线性回归 ,得标准曲线方程： Y=0.054+0.092 610 -6X(r=0.986 0,n=6),两者具有良好的线性关系。见图1。 2.2 挥发油对细胞增殖的作用用 1， 0.1， 0.01， 0.001 mg/ml 4 种浓度的挥发油作用于细胞 24 h，在 550 nm测定其吸光值。结果见表 1 。表 1 不同挥发油浓度对 UMR-106的增殖作用 (略 ) 苍术挥发油浓度 0.001 mg/ml 时培养 24 h，可明显促进细胞的增殖 ,细胞的增殖率为 10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用 ,表明挥发油短期内使用低浓度较好。 为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间 ,用浓度为 0.001 mg/ml的苍术挥发油作用于细胞分别为 24， 48，72 h , 在 550 nm测定其吸光值。结果见表 2。表 2 不同作用时间对细胞增殖的影响 (略 ) 由表 2可见，当挥发油在浓度为 0.001 mg/ml 作用 24 h 时能明显刺激 UMR-106 增殖，在近 48 h 时增殖率为5 / 6 20.96， 达到最强 ,72 h 时细胞数目又下降。 3 讨论 苍术挥发油在 0.001 mg/ml 浓度下作用 24， 48 h，均对 UMR-106 增殖有明显的促进作用。 UMR-106 大鼠成骨肉瘤细胞系从形态和性质上都保留了成骨 细胞独有的特征 , 并且具有稳定、均一、纯度高等优点。 因此 ,UMR-106 细胞作为一种国际公认的成骨细胞系可以用来代替成骨细胞 3。在骨形成最初阶段的成骨细胞增殖期 , 成骨细胞数量增多 , 形成多层细胞并合成、分泌 I 型胶原以便最终矿化形成骨结节。成骨样细胞的增殖与细胞培养液中药物的成分有关 , 与成骨样细胞 UMR-106共同体外培养的方法可能作为对骨形成有促进作用的活性化合物的筛选模型 , 经过进一步的动物体内实验从这些活性药物中追踪对骨形成有促进作用的活性成分。因此，以成骨样细胞 UMR-106 的增殖为活性 指标 ,观察了苍术挥发油对该细胞系增殖的作用。由于采用的是苍术挥发油和细胞共同体外培养的方法 ,推测苍术挥发油中含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分 ,为苍术治疗骨质疏松症提供初步筛选，具体机制有待进一步研究。 【参考文献】 1国家药典委员会 .中国药典， 部 S .