基因工程实验论文-gy.doc

内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 分类号: Q78 编号: 本科生基因工程实验论文碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达 指导教师： 王郑 学 生： 阿迪雅 专 业： 生物工程 年 级： 2012级 2015 年 8 月 16日碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达摘要碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，A P) 是一包含 2 个 Zn2 + 和1 个 Mg2 +的金属酶，纯化后的 AP 被广泛用于生命和医学科学等领域，如蛋白质标记、分子生物学及酶标记免疫分析等，是基因工程常用的工具酶。该酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作碱性磷酸酶基因，将pET-44a-BAP质粒上的碱性磷酸酶基因用PCR扩增出1369bp的碱性磷酸激酶基因片段，与pMD19-T载体连接后导入感受态的DH5菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his，导入BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质，用SDS-PAGE鉴定。关键词：碱性磷酸酶，基因表达，载体，大肠杆菌， SDS-PAGE 引言41实验材料51.1试剂51.2仪器51.3试验用具51.4菌种51.5质粒51.6常用溶液的配制62 方法72.1引物的设计72.2 碱性磷酸酶基因的PCR扩增72.3 DH5和BL21(DE3)感受态的制备72.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测82.4.1 PCR产物(BAP)与pMD19-T（PCR2.1）载体连接82.4.2感受态细菌的转化82.4.3 pMD-19-T-BAP的鉴定（提取质粒使用tiangen试剂盒）82.5 pMD19-T-BAP的酶切和回收92.5.1 pMD19-T-BAP双酶切92.5.2 pMD19-T-BAP双酶切胶回收92.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测102.6.1 pET-his-BAP的构建102.6.2 pET-his-BAP转化BL21102.7 pET-his-BAP的诱导表达112.8 碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测112.8.1电泳槽的组装及配胶112.8.2外源基因的诱导表达123 结果与分析133.1 碱性磷酸酶基因的PCR扩增133.2 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测133.3.1 pET-his的质粒电泳检测143.3.2 pET-his酶切结果电泳分析153.3.3 pET-his双酶切胶回收电泳分析153.4 pMD19-T-BAP双酶切和胶回收分析153.4.1 pMD19-T-BAP的双酶切结果153.4.2 pMD19-T-BAP双酶切胶回收的结果163.5 pET-his-BAP的构建及转化和检测163.6 SDS-PAGE检测碱性磷酸酶的表达174.讨论185.致谢186.感想18参考文献18引言 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应1。AP广泛存在于微生物和动物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。 目前国内制备AP多采用从动物的肝脏和小肠中提取、纯化，这些方法存在着原料有限，生命成本高，不能适应生产上大量用酶的需要等弊端。而采用微生物发酵法则可克服以上缺点，微生物不受气候、地理条件的限制，繁殖较快，并可根据需要选育优良菌株来提高产酶率。 其中大肠杆菌碱性磷酸酶( Escherichia coli alkaline phosphatsae，EAP) 作为生产AP的模型得到最为充分的研究。本研究的意义在于通过基因工程的手段制备出可以表达AP的大肠杆菌，为下游的生产提供目的菌种。除了大肠杆菌外，枯草芽孢杆菌也可用于碱性磷酸酶的制备，二者都属于细菌碱性磷酸酶(Bacterialalkalinephosphatase,BAP)。 对于碱性磷酸酶的相关研究，已从过去动物源性的研究占主导发展到微生物源性占主导，从主要研究其在水生动物中的作用与影响，扩展到其他的生物领域。而且制备手段从简单的提取、纯化，发展到通过构建微生物菌株来批量生产，开发了新的方法，降低了成本。最近研究表明，肠型AP在保持肠道平衡中发挥重要作用，膳食可以影响它的活性，肠型AP具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠pH、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等功能2。就EAP而言，该酶是同源二聚体蛋白3，其单体前体的 N 端有一段22个氨基酸残基的疏水信号肽序列，可引导 EAP 转运到胞周质间隙4-6，有限的周质空间使得产物的表达量很低，致使EAP 制备效率低、成本高。下一步的工作重点将是对表达载体的优化与改进，进一步提高产量。本次研究通过基因工程的手段构建碱性磷酸酶基因的表达载体，对商业化碱性磷酸酶的制备具有重要意义，具有较为重要的科研和经济价值。1实验材料 1.1试剂LB培养基，氨苄青霉素储存液，无菌ddwater， DNA分子量标准（DNA HindIII 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp），电泳级琼脂糖粉，50XTAE电泳缓冲液，10X电泳加样缓冲液，1000X溴化乙锭储存液，10加样缓冲液，6加样缓冲液，PremixTaq，10mg/mLRNaseA， 95%和70%乙醇，EcoRI和BamHI限制性内切酶，10内切酶缓冲液，0.1mol/LCaCl2溶液，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，20%（M/V）IPTG，2%（M/V）X-gal，65%甘，5X电泳缓冲液，100mg/mL（M/V）IPTG，20%葡萄糖，1.0mol/LTrisHCl（pH8.8），0.5mol/LTrisHCl（pH6.8），10%SDS，30%Acr/Bis，10%Aps，2上样缓冲液，TEMED，低分子量蛋白分子量Marker，考马斯亮蓝染液。 1.2仪器 台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床，制冰机，超净工作台，微波炉和电磁炉，电泳仪和电泳槽，电子分析天平，恒温水浴锅，紫外分光光度计，PCR仪，三用紫外分析仪，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅。 1.3试验用具 超净工作台，玻璃涂布棒，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔，手表，摇菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（010uL，20200uL，2001000uL），100mL三角瓶，250mL三角瓶，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块,垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子。 1.4菌种 pET-his质粒载体菌， pET-44a-BAP载体菌，E. coli DH5，E. coli BL21（DE3） 1.5质粒表达载体pET-His长度: 2.9kb基因克隆表达功能区详细序列如下： XbaItctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggatccgcagaattcagcgctagctaacatcatcatcatcattaagctt BamHI EcoRI NheI HindIII多克隆位点： thrombin cut siteLeu Val Pro Arg BamHI EcoRI PT7 RBS ATG 6His CTG GTG CCG CGC GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCTAGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT NheI HindIIIBamHI EcoRI NheI stop HindIII PT7 ATG-6His Thrombin cut site MCS 1.6常用溶液的配制（1） LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL。（2） 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20保存）（3） TAE电泳缓冲液（50x储存液，pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L，使用时稀释成1。（4） 6x加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。（5） 65%甘油：65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0。（6） 1.0mol/LTrisHClpH8.8：称取12.1gTris碱,加50mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH8.8（约加8mL）。让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH8.8，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4保存。（7） 0.5mol/LTrisHClpH6.8：称取6.05gTris碱溶于40mL蒸馏水中，加约48mL1mol/LHCl，让溶液冷却至室温，再用HCl调至pH6.8，加水稀释到100mL终体积。高温高压灭菌后4保存。（8） 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R2500.25g+45mL甲醇+10mL冰醋酸，用ddwater定容至100mL。（9） 20%葡萄糖：8磅灭菌20分钟，添加至100mg/mL氨苄青霉素LB培养基中，终浓度为0.2%。（10） 脱色液：95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比。（11） 2X上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚蓝 0.5mL，-2-巯基乙醇 1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放。（12） 5X电泳缓冲液：Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL，使用时稀释五倍。2 方法2.1引物的设计Sense primer 5- CAGGATCCCGGACACCAGAAATGCCTG -3Antisense primer 5- GCAAGCTTTTATTTCAGCCCCAGAGCGG -32.2 碱性磷酸酶基因的PCR扩增（1） 目的基因模板质粒：已经克隆在pET-44a-BAP载体上的碱性磷酸酶基因；待扩增的BAP片段长度：1369bp（2） 反应体系（在0.2ml PCR 微量离心管中配制50l反应体系）反应体系50ul模板1Primer11Primer21PCR Supermix45dd water2总计50（3） 反应程序 943min30个循环9430s5830s721min7210min（4） PCR结束后，取10l产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。2.3 DH5和BL21(DE3)感受态的制备（1） 取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2） 从超低温冰柜中取出DH5菌种和BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3） 取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养2-3h，测定OD590为0.375（0.4-0.6，细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4） 将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心10min。（5） 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（6） 4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。（7） 4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100mL分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。2.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测2.4.1PCR产物(BAP)与pMD19-T（PCR2.1）载体连接（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416。（2）取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：pMD19-T-BAP连接反应体系 10ulpMD19-Tvector1PCR产物（BAP）3Solution15dd water1总计10（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14水中保温3h。（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4冰箱备用。2.4.2感受态细菌的转化（1） 事先将恒温水浴的温度调到42。（2） 从-70 超低温冰柜中取出一管（100L）感受态菌，立即插入冰上，冰浴510min。（3） 加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。（4） 轻轻摇匀后插入42水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500L LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1h。（6） 在超净工作台中取上述转化混合液150L于新的1.5ml的离心管中，加入40ul20%x-gal，7uL20%IPTG混匀。（7） 将上述菌液滴到含Amp的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。（8） 在涂好的培养皿上做上标记，倒置放入37恒温培养箱过夜培养。（9） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。2.4.3pMD-19-T-BAP的鉴定（提取质粒使用tiangen试剂盒）（1） 在超净工作台中取3支无菌试管，各加入3mL LB（含100mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。（2） 观察菌落生长状态，用10uL枪头挑取3个白菌落分别置于含3mLLB培养基中，37摇菌培养8h。（3） 分别取1.5mL的菌液于1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。再将剩余菌液倒入1.5ml离心管中，12000r/min 离心1min，弃上清。（4） 将留有菌体沉淀的离心管加250ul溶液P1悬浮细胞沉淀。（5） 再向离心管中加250ul溶液P2温和上下翻转6-8次。（6） 向离心管中加350ul溶液P3温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀12000r/min离心10min。（7） 吸取上步中离心上清液并转移到吸附柱，12000r/min离心1min，弃滤液。（8） 将吸附柱置回收集管中，加500ul去蛋白液，12000r/min离心1min，弃滤液。（9） 将制备管置回离心管，加600ul漂洗液PW，12000r/min离心1min，弃滤液。（10） 重复上一步操作。（11） 将吸附柱移入收集管中，12000r/min空柱离心2分钟。（12） 将吸附柱至于干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50ul EB，室温放置2分钟，12000r/min离心2min。（13） 将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断 pMD-19-T-BAP是否连接并转化成功。然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片断大小是否与预期相符。2.5 pMD19-T-BAP的酶切和回收2.5.1pMD19-T-BAP双酶切（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：pMD19-T-BAP双酶切体系 40ulpMD19-TBAP质粒14Quick BamHI1QuickEcoRI110X酶切缓冲液4dd water20总计40（2） 在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再用涡旋振荡器离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在37水浴中温育1 h。（3） 酶切后取9ul酶切产物与先前的PCR产物对比电泳，以鉴定切下的片断是否为BAP预期片断。2.5.2pMD19-T-BAP双酶切胶回收（1） 用1TAE和琼脂糖配制1%回收胶。（2） 从恒温水浴锅中取出酶切产物，分别加入4uL的10LoadingBuffer终止反应，并混匀。（3） 点样（4） 电泳结束后用电话卡将含有大量酶切产物的泳道切下，EB染色含小样的胶块。在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片在目的DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。（5） 将做好切口标记的凝胶与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的胶块上大样的DNA酶切产物的位置。（6） 用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），分别转移至一个事先称量过的、灭活的1.5mL微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。（7） 再用EB染色切除DNA以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把DNA带切走。（8） 按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物。a) 向吸附柱CA2中加入500L的BL，12000r/min1min离心，弃废液，将吸附柱从新 回收到收集管中。b) 将单一的目的DNA条带胶块的离心管中加入3倍体积的溶胶剂PN。c) 在50水浴锅中放置10min，中间隔2-3min轻晃几次，确保胶体完全融化，没有胶体颗粒剩余。d) 将上一步所得的溶液（放置室温后）加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000r/min离心1min。e) 离心后，弃废液。向吸附柱中加入600L，漂洗液pw，12000r/min60s。弃废液。f) 重复上步。g) 空柱离心12000r/min，2min，弃废液。开盖放置，彻底晾干。h) 将CA2，加入新的ep管中，先加入洗脱缓冲液EB80L，放置2min。12000r/min2min。收集DNA洗脱液。（9） BAP胶回收电泳验证2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测2.6.1pET-his-BAP的构建（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416摄氏度。（2）取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：pMD19-T-BAP连接反应体系 10ulpET-his胶回收产物1BAP胶回收产物710x ligation Buffer1T4 Ligase1总计10（3） 将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14水中保温3h。（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4冰箱备用。2.6.2pET-his-BAP转化BL21（1） 将恒温水浴的温度调到42。（2） 从4冰箱中取出一管BL21(DE3)感受态菌，插入冰上。（3） 加入10L连接好的pET-his-BAP质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上25min。（4） 轻轻摇匀后插入42水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5min。（5） 在超净工作台中向上述管中加入300uLLB（不含氨苄青霉素）培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡45min。（6） 在超净工作台中取上述转化混合液300ul，混匀后滴到含合适抗菌素(Amp+)的固体LB平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。（7） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中约30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱中培养过夜。2.7 pET-his-BAP的诱导表达（1） 观察平板上菌落生长状态，选择大小合适的单菌落以便后续试验步骤。（2） 将LB培养基分装到100ml的三角瓶中，后加入氨苄青霉素（100mL/100L）。（3） 将加好（Amp+）的LB培养基分装到灭菌的试管中1.8mL/管（4） 挑菌，37摇床中，进行摇菌扩培。（5） 质粒提取使用tiangen试剂盒，步骤与2.5.1小提质粒相同。（6） 提质粒后进行电泳检测。（7） 将LB培养基配制成含0.2%的LB-葡萄糖培养基（Amp+浓度为120g/ml，即100ml/120 l的比例加入Amp+）（8） 将正确的质粒对应的菌液加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30，慢摇过夜。（9） 至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG至 100g/ml，150-170转/分钟37C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。（10） 4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，走SDSPAGE电泳分析。菌体也可放在-20以下保存备用。2.8 碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测2.8.1电泳槽的组装及配胶（1）组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面，然后用夹子夹住玻璃两侧的中央部位。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm处做一个标记。拔掉梳子，倒入蒸馏水检验是否漏水。如不漏水，弃掉蒸馏水。（2） 配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）： Acrylamide-bis 3.96 mL 1M Tris PH8.8 4.38 mL d.d Water 3.432 mL 10% SDS 118.8 mL TEMED 9.9 mL10%APS 118.8 mL（3） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。（4） 配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：Acrylamide-bis 0.675 mL0.5M Tris pH6.8 0.563 mLdd water 3.165 mL10% SDS 45 mLTEMED 7.5 mL10% APS 45 mL（5） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（6） 配制1X加样缓冲液400mL，从上面的电泳槽倒入，若不从下面的电泳槽漏水，则加满缓冲液，在将下面的电泳槽也加满电泳缓冲液，小心缓慢地拔出梳子。2.8.2外源基因的诱导表达（1） 超净台中接种pET-his-BAP的BL21（DE3）菌空pET-his转化BL21（DE3）菌BL21（DE3）空菌。37摇菌。（2） 150-170r/min摇菌，设置时间梯度对比。统一加3lIPTG进行诱导。（3） 各取1.5ml菌液12000rpm离心15min，弃上清，收获菌体。用20ulddwater重悬菌体，加入20ul的2加样缓冲液，煮沸5min。（4） 电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为：marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL2（DE3）、空载体BL21（DE3）。3a、3b、3c、4a、4b、4c、7b。（5） 电泳时，15mA恒流电泳。直至到条带到支持胶处，改为20mA电流电泳。（6） 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃 板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。（7） 染色考马斯亮蓝染色30min，流水冲掉染料后清水脱色浸泡过夜。（8） 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（BAP蛋白约33kDa），判断是否是预期的基因产物。3 结果与分析3.1 碱性磷酸酶基因的PCR扩增 实验成功克隆了BAP基因，实验结果如图1。M 1 2 3 4 5 6 7图 1 碱性磷酸酶(BAP)基因PCR电泳图将实验室提供的pMD-18-T-BAP质粒进行PCR扩增，在30个PCR循环中，得到BAP基因的扩增片段，进行琼脂糖凝胶电泳，得到图示电泳图，3、4号泳道是我们小组的，与maker对比，鉴定其大小正确，图中有严重的拖尾现象，可能是由于浓度较大。Fig1 Will lab pMD - 18 - T - BAP plasmid for PCR amplification, in 30 PCR circulation, obtain the BAP gene fragments amplified, agarose gel electrophoresis, graphic electrophoresis figure, 3, 4 lane is our team, with a comparison with the maker, the identification of the correct size, diagram has serious trailing phenomenon, may be because of its high concentration.3.2 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测（1）用已经扩增好的PCR产物(BAP)与pMD-19-T（PCR2.1）载体直接连接。并将连接好的pMD19-T-BAP质粒导入DH5感受态菌中，进行诱导鉴定。将转化的DH5感受态菌，摇菌培养后涂平板。涂到LB(Amp+)的固体培养基中，过夜培养，进行蓝白斑鉴定。将每个平板挑取三个白菌落一个蓝菌落分别加入加了3mlLB(+Amp)的试管中标记，在超净工作台中工作。然后培养3h。（2）将培养的菌取出按照试剂盒提质粒，后进行电泳鉴定。结果如图2所示。 1 2 3 4 5 6 7图 2 pMD19-T-BAP质粒电泳检测2、3、4号泳道我组为白色菌落电泳图，其电泳图出现3条带，可能是质粒的3种不同的构象，也有可能挑选的不是单菌落。Fig2 2, 3, 4 lane I am a white colonies electrophoregram group, the electrophoresis figure 3 stripes, may is the conformation of three different plasmid, may also be selected is not a single colony.3.3 pET-his质粒提取、酶切和胶回收检验3.3.1 pET-his的质粒电泳检测1 2 3 4 5 6 7 图 3 pET-his的质粒电泳检测 图中1-4号泳道均为pET-his质粒的电泳图，本组的为1、2号泳道。 Fig3 illustrating 1-4lanes are pET - his plasmid electrophoresis figure, our group for lane 1 and 2.3.3.2 pET-his酶切结果电泳分析 图4 pET-his酶切电泳结果 图4 pET-his质粒双酶切双酶切pET-his，并对酶切产物进行电泳，结果如图4所示：2-3号泳道为pET-his双酶切产物，1号泳道为BAP，6号泳道为没有酶切电泳图，7号电泳图为pET-his，分析可知，双酶切后的产物条带大小小于pET-his的，并且大小与预期的结果一致。Fig4 Double enzyme pET - ihs, electrophoresis and enzyme products, the result is shown in figure 4:2-3 lane for pET product - his double enzyme, 1 lane for BAP, lane no. 6, no enzyme electrophoresis figure, 7 electrophoresis in pET - ihs, analysis shows that after the double enzyme product of stripe size is less than pET his, and the size are consistent with the expected result. 1 2 3 4 53.3.3 pET-his双酶切胶回收电泳分析图 5 pET-his双酶切胶回收电泳图图示1、2、3、4、5均为pET-his双酶切胶回收电泳图，本组为1号泳道，条带较亮，故分析胶回收浓度较大，效果较高。Fig5 Here is 1, 2, 3, 4, 5 are pET - his double enzyme cut plastic recycling electrophoresis figure, for lane 1, stripe is bright, so the analysis of plastic recycling concentration is larger, higher effect. 3.4 pMD19-T-BAP双酶切和胶回收分析3.4.1pMD19-T-BAP的双酶切结果 pMD19-T-BAP双酶切的结果如图6所示。1 2 3 4 5 6 7 8图 6 pMD19-T-BAP的双酶切电泳图图示1号泳道为蓝菌落质粒，2号泳道为pMD19-T-BAP重组质粒，3、4、5号泳道为pMD19-T-BAP的双酶切电泳图，7号泳道为BAP PCR产物条带。PCR产物出现两条带可能是由于长时间放置污染或分解，双酶切电泳条带与蓝菌落和pMD19-T-BAP重组质粒比较，经鉴定已切开。我们需要的是和PCR产物大小相近的小片段，所以采用这些酶切结果进行胶回收。 Fig6 Blue bacterial colonies plasmid is seen lane 1, and 2 lane pMD19 - T - BAP recombinant plasmid, 3, 4, and 5 lane pMD19 - T - double enzyme electrophoresis figure of BAP, 7 lanes for stripe BAP PCR products.PCR products appear two bands may be due to the long placed pollution or decomposition, double enzyme electrophoresis banding and blue bacterial colonies and pMD19 - T - BAP recombinant plasmid, identified has been cut.What we need is a small fragments of similar size, and the PCR products by the enzyme so that the result of plastic recycling.3.4.2pMD19-T-BAP双酶切胶回收的结果1 2 3图 7pMD19-T-BAP双酶切胶回收电泳图 图中1、2号泳道为胶回收条带，亮度较暗，可能是回收浓度较低。3.5 pET-his-BAP的构建及转化和检测提取构建的质粒载体，为构建成功。电泳检测结果如图8所示，7泳道为pET-his空质粒（2.9Kb）作为对照，1、2、3泳道为提取质粒的电泳结果，其中1、2泳道几乎没有条带，分析知由于在提取过程中只过了一次柱，再者质粒浓度低，所以就导致没有提取到。3泳道目的条带的大小与pET-his空质粒的大小（2.9Kb）一样，意味着我们的构建的载体中没有BAP片段，可能由于pET-his发生自连。 图8：pET-his-BAP的构建结果 M：DNA/Hind DNA Marker 7： pET-his对照 Fig 8 PET - his - BAP build results3.6 SDS-PAGE检测碱性磷酸酶的表达 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 图9 SDS-PAGE电泳图 图9 SDS-PAGE电泳结果 将正确的质粒对应的菌液加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30，慢摇过夜，加入IPTG进行诱导，本组做的是时间梯度。条带不平齐可能是由于制胶时中间浓度过大造成的。Fig9 Add the correct plasmid corresponding bacteria liquid 6 ml of LB - 30 , glucose medium medium slow shake overnight, add IPTG induction, this time gradient.Stripe not level may be caused due to the large, middle concentration when making a glue.4.讨论本实验