基因重组和基因工程总结-贻宏.doc

DNA的重组同源性重组为在两个同源序列间进行单链或双链片段的交换。左边为片段重组体（切开的链与原来断裂的链是同一条） 右边为拼接重组体E.coli的同源重组RecA蛋白携带单链DNA对双链DNA的入侵 RecBCD复合物负责切开双链和对双链进行解旋，有内切酶和外切酶和解旋酶的活性，都需要ATP. 还需要DNA连接酶，和RuvC内切酶进行中间体的切割。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其35外切酶活性受到抑制，53外切酶活性被激活，由原来优先降解3末端链，改变为只降解5末端链。RecBCD酶活性变化的结果是产生3末端带有Chi位点的ssDNA。分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶.特异位点重组1 噬菌体DNA的整合通过整合酶识别其与大肠杆菌的重组位点内的相同序列。整合十分高效。反转录病毒的整合酶则将LTR（内含增强子和启动子）整合到宿主。2. hin基因编码倒位酶 hix（为反向重复序列）为特异性的重组位点，这个地方一重组，应该会导致第一个启动子激活，引起hin基因的表达，表达的产物又连到hix位点上，在辅助因子Fis的作用下，h片段倒位。（h片段位于2个hix之间，所以是hix先倒，再倒H片段）3. 免疫球蛋白的基因重排3个基因族 2个编码轻链（和） 1个编码重链 轻链有LVJC 重链LVJCDL为前导片段 D 为多样性片段 VJ和VDJ重排都是在特异位点，RSS为重组信号序列，含有回文7核苷酸序列，为切割位点，含富含A的九核苷酸序列为识别位点。RAG为重组酶基因，产生2种重组酶。第一次重组在转录前，第二次为受抗原刺激，改变恒定区，发生类别转化。T细胞的基因重排也与上面相似。转座重组transposition就是由插入序列和转座子介导的基因移位。插入序列两端为两个反向重复序列。有保守性转座和复制性转座。由转座酶起内切酶和形成磷酸二酯酶的作用，还有催化最后的位点特异性重组，在复制性转座中。转座子就是可以在染色体上移动的基因，对其他的基因活性进行调控。与插入序列不同的是，它含有抗性基因等有用基因。细菌的基因转移与重组 此为接合作用，一般为细菌染色体 外的小型环状双链DNA分子。转化作用Transformation转导作用 Transduction 就是病毒为媒介进行DNA的传播。 DNA克隆（DNA重组）将遗传物质与载体DNA结合，形成有自我复制能力的复制子，然后通过转化或转染宿主细胞，再筛选出含目的基因的细胞，对其进行扩增，以获得大量的DNA分子。工具酶限制性核酸内切酶 常用类，、类的特异性不高。识别的核苷酸序列为回文序列。切割后产生平端切口、粘端切口。通常识别4、6、8个碱基序列。命名 同尾酶不同位点，相同末端（称配伍末端）。同裂酶不同酶，相同位点。碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团P5OH3OH3P5，防止载体的自连接。有BAP（来自细菌的碱性磷酸酶）和CIP（来自牛小肠的碱性磷酸酶）用完之后要用多核苷酸激酶使其重新磷酸化。Taq DNA聚合酶具有53聚合酶活性及53外切酶活性，但没有35外切酶活性，因而无35校对活性。因此在PCR中如果发生错配，则没有校正功能。可考虑用新的耐高温酶进行替代。图为TA克隆 利用Taq酶同时具有末端转移酶的活性，在合成的DNA的3端加上一个A 就可与载体3端的T连接。cDNA文库和基因组文库都是把基因接种在菌种上，可采用菌落或噬斑原位杂交法进行筛选，探针用目的基因的部分序列或者高度同源基因的部分序列或者推演出来的核苷酸序列。PCR必须已知待扩增基因或DNA两端的序列，并提供合适引物。载体克隆载体和表达载体载体的选择要分子量小，才能容纳足够大的DNA分子，还有数量要够多，2个以上的标记位点，多为抗性基因，-半乳糖苷酶基因lacZ。还有有多克隆位点（即酶切位点）常用有质粒DNA（位于细菌染色体外）、噬菌体DNA、病毒DNA。1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）需要一个强的启动子 还要有翻译调控序列 还要有多接头克隆位点 还有有marker 当然缺点就是不宜表达真核生物的基因，因其没有进一步的修饰功能，表达的蛋白容易形成不溶性包涵体，很难表达大量可溶性的蛋白。还需要SD序列，用于结合核糖体，其位于起始密码子上游。 还有TT转录终止序列，可以控制转录RNA的长度，可位于启动子上游和编码序列下游。R为调节序列。融合型载体和非融合型载体和分泌型表达载体，分泌型表达载体还需要含编码信号肽的序列，通常位于SD序列的下游。2 真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物）可表达克隆的cDNA和真核的DNA，表达产物会分区积累。转染技术 将表达载体导入真核细胞（除酵母细胞）的过程或将噬菌体DNA导入细菌的过程。转化是质粒的DNA直接导入细菌或酵母细胞。感染为借助噬菌体或病毒将外源DNA导入宿主细胞。磷酸钙转染其原理是借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。DEAE葡聚糖介导转染DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。脂质体转染 显微注射与原核相比，多了真核调控序列，主要是增强子 还有真核起始序列 还有不是所有整合表达载体都有整合序列。还有多了polyA加尾信号，真核细胞药物抗性基因。单一的黏端连接易产生载体自连和多拷贝现象和DNA片段的反向插入。这时用两种限制性内切酶分别切割载体和目的DNA，形成两个不同的黏性末端就可以避免这种情况的发生，实现定向克隆。-互补筛选 糖苷酶要在两个片段都存 在的情况下才有活性，当外源基因插入，片段基因完整性破坏，表达失败，所以无法分解底物，使其在IPTG存在的情况下，变成蓝色，故显白色。重组技术应用 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。制备单抗和生长因子等。基因治疗用于治疗单基因病和重症联合免疫缺陷和帕金森病等。基因诊断 Southern印记杂交用于诊断基因缺陷Northern印记杂交用于检测mRNA筛选重组DNA的方法 1 利