实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用.doc

实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用 周雪花 云南省文山州疾病预防控制中心，云南文山663000 摘要目的探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果。方法选取xx年9月xx年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件进行分析，采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，观察检测阳性率和阳性样本的类型，以分析流感的流行趋势。结果xx年9月xx年12月共检出流感病毒核酸阳性676件，检测阳性率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P0.05）。每年69月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在1011月达到高峰期；69月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株，1011月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。结论实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法，可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测，分析流感病毒的流行规律，有效预防突发公共卫生事件的发生。 关键词实时荧光定量pcr；流感；病毒核酸；检测；应用 R440A1672-5654（xx）10（a）-0178-02 作者简介周雪花（1977-），女，汉族，本科，主管检验师，云南文山人，主要从事临床检验，微生物检验工作。 xx年3月份在墨西哥爆发甲型H1N1流感，并且迅速蔓延至全球，使人们意识到预防流感的重要性1-2。为了探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果，本文选取xx年9月xx年12月在我市某地区采集的流感样病例咽拭子2489件作为研究对象进行分析，结果汇报如下。 1资料与方法 1.1一般资料 于xx年9月xx年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件。 1.2方法 1.2.1采集2489件咽拭子是擦拭双侧咽扁桃体和咽后壁，剪去一部分放置在无菌病毒采样液中，以4的条件下保存，尽快送至实验室，其中疑似甲型H1N1病毒的病例采用A类包装。 1.2.2试剂和仪器采用STRATAGENEMX3000P实时荧光定量PCR仪。试剂盒采用QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)病毒核酸提取试剂盒，及其配套的试剂，其阳性检测结果对比参照试剂盒配套说明书。 1.2.3检测方法RT-PCR快速检测试验步骤 （1）流感病毒核酸提取QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)：取一支无菌、无酶的1.5mlEppendorf管，加入500ulRLT。取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100uL，加入上述Eppendorf管中。加5uL-巯基乙醇，充分混匀。加600uL70%乙醇，于旋转混合器混匀。从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。将第4步的混合液分两次（每次600uL）吸入于滤柱中，12000rpm离心15s，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm离心15s，弃收集管中液体。于滤柱中加入700uLRW1，12000rpm离心15s。从试剂盒中取出一支新的2mL收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500ulRPE，12000rpm离心15s弃收集管中液体。滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500uLRPE，1300014000rpm离心2min。从试剂盒中取出一支1.5mLEppendorf管，将滤柱转到新的1.5mL管上，于滤柱中加入3050uL无RNA酶的水，室温静置13min。12000rpm离心1min，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20以下保存，-30可保存34个月。 注意事项：试剂盒中的RPE液用前需加44mL无水乙醇，使终体积达到55mL；所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜；每步均需要更换枪头。 （2）在洁净缓冲间、二级生物安全柜配制RTPCR(realtimePCR)反应液。（以下均存-20）： 一对特异引物和寡核苷酸探针（季节性FLuA、FLuB、H1、H3、H5、H7、H9等）。 手掌型离心机离心1520s后（防止突然开盖引物和探针飘走），按各自标注的OD值加入无酶水，混匀，离心即为储备液。依据说明书，各相应的一对特异引物（F、R）按2.5倍稀释、寡核苷酸探针（P）按5倍（有的为10倍稀释）即为使用液 各季节性流感反应体系（按n+2用量配制）及其反应条件(需根据引物调整)。 RT-PCRMasterMix12.5uL605min/5030min/9515min(1个循环) RT-Mix0.25uL9515s/5530s/(收集荧光)/7230s DH2O5.75uL（45个循环） F(5上游引物使用液)0.5uL725min（1个循环） R(3下游引物使用液)0.5uL P（寡核苷酸探针使用液）0.5uL 新甲型H1N1(猪甲流-xx)北京金豪试剂反应体系（按n+2用量配制）及其反应条件。 H1N1各反应液2000rpm离心10s5030min/953min（1个循环） （FLuA、SWH1、SWFFLuA、RNP内标）各20uL9515s/5030s/721min 各反应液分别加逆转录酶0.35uL（5个循环） DNA聚合酶1uL （混匀离心）9510s/5540s(收集荧光)（45个循环） 于提取间，反应体系20uL+模板RNA提取液5uL。进行PCR扩增反应。阳性：Ct值35.0，并且呈现S形曲线,阴性：Ct值为0。 1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料采用2检验，计量资料采用t检验，用（xs）表示，P0.05说明具有统计学意义。 2结果 2.1流感病毒核酸检测阳性率 xx年9月xx年12月的2489件流感样病例咽拭子中，共检出流感病毒核酸阳性676件，阳性检出率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P0.05）。结果见表1。 2.2流感病毒流行特征 每年69月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在10月次年3月达到高峰期；69月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株，10月次年3月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。 3讨论 流感之一种急性呼吸系统疾病，主要由流感病毒引起，临床症状主要表现为高热、酸痛、乏力、呼吸道症状等。流感传染性强、潜伏期短、传播迅速，可分为甲、乙、丙三种类型，其中以甲型流感对人们的威胁最大3-4，因而必须加强对流感的检测和防控。 流感病毒致病能力较强，而且容易发生变异，而且人们对特异性菌株缺乏必要的免疫力，因而会导致流行暴发。相关研究表明，一场大型流感会导致整个地区的寿命降低5，因而必须加强流感的防控，为此我市疾病防控中心采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，取得了良好的效果。 实时荧光定量PCR检测具有明显的优点，相比于普通的RT-PCR检测来说，其实验周期更短，灵敏度更低，而且不容易造成实验室污染6。实时荧光定量PCR检测能够利用PCR对DNA的高效扩增、光谱技术的敏感性和探针技术的特异性，敏感性较高，重复性好，而且更为直观，操作简单，容易操作，采用闭管检测对实验室的污染能够降到最低，因而具有良好的实用性；采用磁珠法进行提取核酸，能够最大限度的结合核酸，而且清洗效率高，能够实现自动化提取，操作方便7-8。 通过本研究发现，xx年9月xx年12月共检出流感病毒核酸阳性676件，检测阳性率为27.16%；其中甲型H1N1病毒最多，各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P0.05）。此外，每年9月次年的3月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势。这充分证明了实时荧光定量PCR检测的优势。 但是在实验室检测中要注意以下几点：要对实验室区域进行严格区分，不同实验区域采取不同的专属器械；在样品提取后能够进行立刻检测的要进行立刻检测，否则会降低检验的准确率，如果无法立即进行检测要进行冷冻保存；整个检测过程要在低温环境下进行；移动液也进行严密的校准，操作过程要熟练，防止发生遗漏事件的发生；要注重检测过程中的污染问题，采取75%的乙醇对实验台面进行擦拭，对周围环境采取紫外线消毒，以减少污染的发生9；另外，相关研究也证明10，尽管检测流感病毒核酸的试剂和仪器很多，但是并不是所有的试剂与仪器都能达到的最好的匹配，因此，在进行实验室检测时还要多次进行校准试验，针对不同的试剂和仪器进行匹配性试验比较，找出最佳匹配方案，使实时荧光定量PCR的检测结果更加快速、准确，敏感性、特异性更高。 综上所述，实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法，可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测，分析流感病毒的流行规律，有效预防突发公共卫生事件的发生。 参考文献 1葛琴娟，杨静，孙晋飞，等.实时荧光定量PCR法检测镇江市流感样病例样本的结果与分析J.实用预防医学，xx，17(4)：755-757. 2刘建荣，宋淑娥，何莹，等.实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用J.职业与健康，xx，1(9)：1000-1002. 3陈棋炯，孙永祥，丁水军，等.应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒J.中国卫生检验杂志，xx，1(6)：1394-1396. 4区伟全，卢国钧.实时荧光定量PCR在铁路运输动物携带甲型流感病毒检测中的应用J.热带医学杂志，xx，11(7)：828-829. 5郭泗虎，王文华，张亮权，等.H3亚型猪流感病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立J.中国预防兽医学报，xx，34(2)：124-127. 6杨楠，张广宇，李洪敏.甲型H1N1流感病毒的流行病学特点分析J.国际呼吸杂志，xx，33(6)：403-406. 7尹航，杨焕良，陈艳，等.甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立J.中国预防兽医学报，xx，35(1)：36-39. 8熊