ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究.doc

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究 张艳平 常德职业技术学院医学系，湖南常德415100 摘要目的观察BHRF1shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌E2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法利用RNAi技术将负载BHRF1shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌E2细胞，一组为BHRF1shRNA质粒载体转染过的E2细胞（观察组），未进行转染的E2细胞确定为对照组，经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1cDNA片段，RT-PCR和Westernblot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达。并且利用顺铂进行实验，观察使用顺铂后，BHRF1shRNA转染后的肿瘤细胞是否对放射敏感性有变化。结果BHRF1shRNA转染鼻咽癌E2细胞后，细胞内BHRF1mRNA表达量（2.020.53），对照转染前明显下调，明显下调，与对照组的（29.820.64）比较，差异有显著性意义（P0.01）；DDP和8G放疗作用24h以后，被转染的细胞的中的蛋白表达大大降低（P0.05），癌细胞凋亡率上升，明显比对照组癌细胞的凋亡率高（P0.05）。结论利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。 关键词bhrf1shrna；e2细胞；bhrf1；顺铂；rt-pcr R733.7A1672-5654（xx）07（c）-0046-03 鼻咽癌(Nasoplmryngealeareinorna，NPC)的发生具有明显种族和地区分布特征，对其诊断和治疗还存在着种种难点，因此，研究鼻咽癌发生和转移的分子机制，成为目前鼻咽癌研究领域的重点之一。在鼻咽癌的发生发展当中，EB病毒(EBV)早期基因BHRF1(BamHIHrightfragment)是近年来新确认的一种EBV致癌基因，其可上调抗凋亡基因P53的表达，削弱宿主对潜伏于肿瘤细胞中的EB病毒的免疫反应。基于此，本研究观察BHRF1shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌E2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。 1资料与方法 1.1一般资料 选取我院xx年1月xx年12月间收集的鼻咽癌手术患者20例为研究对象，20例患者中有5例女性15例男性，年龄从3469岁不等，平均年龄47.3岁。所有患者确诊后进行手术，术中病理切片，并分离出人鼻咽癌E2细胞，将这些细胞按照患者入院编号单双号平均分为两组，一组对其进行BHRF1shRNA质粒载体转染，设置为观察组，一组不进行转染，设置为对照组，每组10例。 TrizoltotalRNA试剂盒，BHRF1shRNA序列，由Qiagen公司合成，构建靶向表达载体，应用体外转染试剂转染E2细胞。 RPMI-1640完全培养基购自美国Gibco公司。 Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。 蛋白提取试剂：碧云天RIPA蛋白提取及配套试剂。 蛋白定量试剂：碧云天BCA蛋白定量试剂盒。 实验仪器：转膜仪BIO-RAD半干式转膜仪。 1.2方法 进行转染，然后RT-PCR和Westernblot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达，选取各观察点细胞，吸去细胞完全培养基，用PBS冲洗2次，直接在细胞培养皿中加入1mLTrizol裂解细胞，用移液器反复吸打几次，然后室温下静置5min。将细胞裂解液吸至1.5mLEP管中，轻轻颠倒混匀，室温下静置2min。按每1mLTrizol中加0.2mL氯仿的比例，加入氯仿。在蜗旋器上振荡15s，使其充分混匀，室温下静置5min后，离心（4，12000g，15min），离心后，混合液分成三层，最上层为无色的水相，占总Trizol的60%。将含有RNA的水相轻轻吸取到新的1.5mLEP管中，加入0.5mL的异丙醇，颠倒数次使其混匀，室温下静置10min后，离心（4，12000g，10min），小心吸掉上清，留取沉淀。获得的RNA经检验符合实验要求后，立即取1gRNA进行逆转录，将mRNA反转录成cDNA，剩余的RNA保存于-80超低温冰箱中。具体逆转录操作按照TaKaRa逆转录反应试剂盒（PrimeScriptTMRTReagentKit）操作说明执行。 取上述RT反应液加入下一步RealTime-PCR反应体系，按下列组份配制RealTime-PCR反应体系，共20L：10LPremixExTaqTM(2)，0.8L上游引物，0.8L下游引物，2LcDNA，0.4LROXReferenceDye(50)，ddH2O定容到20L。反应条件：预变性9515m；变性9460s，退火5860s，延伸7260s，共40个循环。得出各标本基因和-actin基因表达量的相关数据（Ct值），数据经内参照基因校正后，按下列公式计算PANC-1mRNA相对表达量。公式：细胞系PANC-1mRNA相对表达量=2-Ct，其中Ct=Ct(PANC-1)-Ct(-actin)。数据采用仪器自带软件分析:ABIPrism7500SDSSoftware 1.3统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计。计数资料用率表示，采用2检验；相关关系采用Spearman等级相关，以P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1BHRF1mRNA表达变化 RT-PCR检测结果显示，观察组的BHRF1mRNA表达比较转染前发生显著降低(P0.01)。与对照组细胞BHRF1mRNA表达相比也明显降低(P0.05)。详细数据见表1所示。 2.2对DDP的敏感性 为了进一步探讨BHRF1shRNA质粒载体转染后的癌细胞后对DDP的敏感性的变化，我们检测了两组细胞对DDP的敏感性。经过实验，得出两组癌细胞在DDP使用以后24h和48h的抑制率。具体数据见下表2所示。 结果（meanSD）说明DDP作用24h和48h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA明显更加有效(P0.05)，说明导入BHRF1shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。 3分析 关于BHRF1shRNA通过何种途径发挥其抑制了鼻咽癌细胞增殖作用，本文通过实验结果已经证实。在本研究中RT-PCR检测结果显示，观察组的BHRF1mRNA表达比较转染前发生显著降低(P0.01)。与对照组细胞BHRF1mRNA表达相比也明显降低(P0.05)。说明了BHRF1shRNA可靶向抑制BHRF1mRNA的表达，使E6蛋白表达下调，减小对p53的降解作用，从而恢复p53蛋白的功能活性，p53蛋白积累，DNA复制停止，介导细胞停滞在G1期，分析可能是其抑制鼻咽癌细胞生长的重要机理之一，该研究为进一步研究通过干扰基因表达对癌细胞增殖的抑制方面提供了理论基础。目前，临床报道的文献多采用免疫组化的方法检测到鼻咽癌组织中p53蛋白呈阳性表达，但很少发现p53基因有突变。因鼻咽癌不同于其他部位的肿瘤，癌组织内p53基因突变率极低。这就意味着野生型p53蛋白功能失活在鼻咽癌的恶性转化和肿瘤的发生发展中起着十分重要的作用。Huang等在研究p53表达与鼻咽癌及癌前病变之间的关系时指出，p53蛋白的过度表达不仅与肿瘤的发生有关，而且与鼻咽癌的分期显著相关。 而且本研究还检测了两组细胞对DDP的敏感性，经过实验得出两组癌细胞在DDP使用以后24h和48h的抑制率。结果（meanSD）说明DDP作用24h和48h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA明显更加有效(P0.05)，说明导入BHRF1shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。 综上所述，本研究利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。 参考文献 1AusubelFM,KingstonRE,SeidmanJG,等.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南M.北京:科学出版社,1998,120-145. 2PrattZL,KuzembayevaM,SenguptaS,etal.ThemicroRNAsofEpstein-BarrVirusareexpressedatdramaticallydifferinglevelsamongcelllinesJ.Virology,xx,386(2):387-397. 3王君,百祥.药物与DNA相互作用的分析测试方法J.医药导报,xx(5):234-235. 4KimdoN,SongYJ,LeeSK.TheroleofpromotermethylationinEpstein-Barrvirus(EBV)microRNAexpressioninEBV-infectedBcelllinesJ.ExpMolMed,xx，43(7):401-410. 5JingYZ,WangY,JiaYP,etal.PolymorphismsofEpstein-BarrvirusBHRF1gene,ahomologueofbcl-2J.ChinJCa