慢性淋巴细胞性白血病患者m1R93甲基化异常及其意义.doc

慢性淋巴细胞性白血病患者m1R93甲基化异常及其意义 周毅任国敏杨聪慧任春霞孟庆鹏 【摘要】目的本研究旨在探讨microRNA-9-3（miR-9-3）在慢性淋巴细胞性白血病骨髓细胞中的甲基化异常及其意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术检测8例正常骨髓组织、78例新确诊的慢性淋巴细胞性白血病患者和7种白血病细胞株甲基化水平。结果正常对照组miR-9-3呈未甲基化状态；7种白血病细胞株中有5种呈未甲基化状态（71.4%）；78例慢性淋巴细胞性白血病患者中65例呈miR-9-3甲基化，MSP阳性率为83%。5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-AzaDc）处理白血病细胞株后I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR-9-3呈未甲基化状态。结论慢性淋巴细胞性白血病患者存在miR-9-3表达受抑，可能与其基因甲基化异常有关。而miR-9-3甲基化在激活慢性淋巴细胞性白血病患者NF-B1信号通路的作用值得进一步研究。 【关键词】慢性淋巴性白血病miR-9-3甲基化特异性聚合酶链反应5-氮杂-2-脱氧胞苷 【Abstract】ObjectiveThisstudyisaimtoexploretheabnormalexpressionofmicroRNA-9-3（miR-9-3）inchroniclymphocyticleukemiaanditssignificanceMethodMethylationofmiR-9-3wasstudiedineightcasesnormalbonemarrowtissue，seventy-eightdiagnosticchroniclymphocyticleukemiasamples，andsevenchroniclymphocyticleukemiacelllinesbymethylation-specificpolymera-sechainreaction（MSP）.ResultmiR-9-3wasunmethylatedinnormalcontrols，butmethylatedinfiveofsevenchroniclymphocyticleukemiacelllines（71.4%）.Amongthe78casewithchroniclymphocyticleukemia，65caseweredetectedmiR-9-3methylationandthepositiverateofMSPis83%.Whereas，miR-9-3showedanunmethylatedstatusinthelymphocyticleukemiacelllines，I83-E95andWAC3CD5+cellswith5-Aza-2-deoxycytidine（5-AzaDc）treatment.ConclusionTheunderexpressedofmiR-9-3mightberelativetoitsabnormalmethylation.TheroleofmiR-9-3methylationintheconstitutiveactivationofNFB1signalingpathwayinchroniclymphocyticleukemianeedstobefurtherstudy. 【Keywords】Chroniclymphocyticleukemia，MiR-9-3，Methylation-specificpolymerasechainreaction（MSP），5-Aza-2-deoxycytidine（5-AzaDc） 【Authorsaddress】DepartmentofClinicalLaboratory，ThePeoplesHospitalofShangZhi，Shangzhi，Heilongjiang，China，150601 doi：10.3969/j.issn.1671-332X.xx.10.005 DNA甲基化是指通过化学修饰在DNA甲基转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基（-CH3）基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CpG）二核昔酸胞嘧啶的5位碳原子上，导致5-甲基胞嘧啶的形成1。肿瘤抑制基因CpG岛相关启动子的基因特异性DNA甲基化是众多人类肿瘤标志物2-3。多个肿瘤抑制基因的甲基化涉及白血病，淋巴瘤和骨髓瘤的信号通路的失调，由此表明肿瘤抑制基因的甲基化在血液癌症发病机制中的重要性4-6。值得注意的是，肿瘤抑制基因DNA甲基化在慢性淋巴细胞性白血病的发病或预后中发挥作用7。慢性淋巴细胞白血病是欧美成人最常见的白血病类型，我国较少见，为主要源于B淋巴细胞的单克隆性小淋巴细胞疾病8。在本实验中，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术研究了miR-9-3的甲基化，旨在确定其在慢性淋巴细胞性白血病的致病作用。 1材料与方法 1.1研究对象 慢性淋巴细胞性白血病共78例，均内蒙古牙克石市人民医院。男51例（65.4），女27例（34.6），年龄3791岁，平均年龄65.0岁，经诊断符合白血病FAB国际诊断标准。所有病例均为新诊断且未接受过放化疗、诱导分化及骨髓移植等特殊治疗。采集肝素抗凝骨髓12ml/份，收集骨髓单个核细胞，于-80保存。8例正常供髓者单个核细胞设为对照组（取自健康志愿者外周血B细胞CD19，N=3；取自健康志愿者外周血血浆，N=2；取自健康志愿者骨髓单个核细胞，N=3）。 1.2细胞株培养 人类白血病细胞株CLL-AAT、MEC1、MEC2、I83-E95、WAC3CD5+、HG3和232B4由内蒙古牙克石市人民医院血液病科赠送。细胞分别保存在含有10胎牛血清的RPMll640营养培养基（含青霉素100U/ml和链霉素100ug/ml），置于320%O2、5%CO2、37培养箱培养的细胞培养箱培养。每4872h用含有0.02%EDTA、0.01%胰蛋白酶的消化液消化后，进行常规传代培养。实验采用对数生长期细胞。 1.3甲基化特异性聚合酶链反应（MSP） 按照QIAampDNAMiniKit（QIAGEN，Germany）的操作步骤结合DNA/RNA提取仪（QIAcube）输入程序即可快速抽提78例慢性淋巴细胞性白血病患者骨髓标本和7种慢性淋巴细胞性白血病细胞株DNA，同样方法提取8例正常对照提取DNA。每个样品用两组引物，其中一个针对修饰的甲基化DNA（M），另一个是针对修饰的未甲基化DNA（U）。重亚硫酸氢盐处理：加入新鲜配制的20mmol/L氢醌12.6ul和4.8mol/L亚硫酸氢钠（pH=5.0）320ul，PCR仪上进行下面循环：5515min，9530s，一共20个循环。以EZDNAMethylationkit对基因组DNA进行修饰。修饰后的DNA溶解于20ul的M-ElutionBuffer，反应产物在20g/L的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。 1.4MSP测序 首先应用亚硫酸钠对DNA进行化学修饰，并用作模板，MSP检测miR-9-3基因启动子区DNA序列。将DNA中所有未甲基化的胞嘧啶（C）转化成为胸嘧啶（T），但有甲基化修饰的C经亚硫酸钠处理后仍保持为C。该步骤应用EpiTectBisulfiteKit（QIAGEN，Germany），按照说明书完成。使用PSQ检测设计软件设计引物。正向引物：5-GAAGGGGGTTGGGATTTGA-3；反向引物：5-ATTTCTCCCCTACTCCCC-3。 1.55-氮杂-2-脱氧胞苷（5-AzaDc）处理 取细胞在对数生长期的I83-E95和WAC3CD5+细胞株，按照1106个细胞/ml的密度接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，5%CO2、37的条件下培养。用终浓度为0.5uM的5-AzaDc处理，每24h更换新鲜的5-AzadC，在第0天和第5天分别收获细胞。 1.6Westernblot检测NF-B1 I83-E9548细胞株转染48h后收集细胞。加入RIPA裂解液（50mM的Tris-HCl，pH=7.4，150mM氯化钠，0.2SDS，1TritonX-100，2mMEDTA），Bradford法测定蛋白浓度，取20ug蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，PAGE胶上的蛋白用Bio-Rad微型电转移至0.2um的硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜加入NF-B1，4下孵育24h，然后将膜洗涤，加入抗兔辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，室温下反应1h洗膜，曝光，X-胶片经显影、定影后扫描记录。以Anti-actin为内对照。 2结果 2.1慢性淋巴细胞性白血病miR-9-3的MSP结果 78例慢性淋巴细胞性白血病患者中65例miR-9-3甲基化，MSP阳性率为83%（见图1）；所有8例正常对照组（N1至N8）miR-9-3全部呈未甲基化状态（见图2）；7种慢性淋巴细胞性白血病细胞株miR-9-3甲基化表达谱显示：I83-E95和WAC3CD5+细胞株显示miR-9-3完全甲基化，232B4，CLL-AAT和HG3部分甲基化，而MEC1和MEC2完全未甲基化（见图3）。miR-9-3MSP产物序列分析显示，与miR-9-3原序列相比，除了甲基化的C外，所有的C均被转化为T，而CpG位点中被甲基化的C未被转化。说明我们的转化方案不仅是高效的，也是特异的（见图4）。 2.25-AzaDc对miR-9-3甲基化程度的影响 结果表明，处理前I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR -9-3呈甲基化状态，而用5-AzaDc处理后，I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR-9-3呈未甲基化状态。 2.3转染miR-9-3对I83-E9548细胞株NF-B1蛋白水平的影响 I83-E9548细胞株转染48h后收集细胞，提取细泡的蛋白，采用用Westernblot法来比较各组细胞内NF-B1蛋白P105和P50的含量。转染miR-9-3后NF-B1蛋白P105/50表达水平降低。如图6所示，miR-9-3组与对照组相比NF-B1蛋白水平降低。 3讨论 成熟的microRNA（miRNA）是一类长度约21-25nt的真核生物内源性非编码单链RNA分子，它在细胞内通过碱基互补与相应的信使RNA（mRNA）的3-非编码区（3-URT）结合，使其降解或抑制其翻译，在细胞的分化、增生、凋亡、个体发育及机体代谢中起着重要作用9，其功能是抑制其靶蛋白的表达10。在癌变过程中，miRNA可分为致癌基因和抑癌基因的miRNA9。最近研究表明，癌症患者抑癌基因的miRNA异常DNA甲基化沉默。以往的研究还确定一些抑癌基因的miRNA甲基化参与慢性淋巴细胞性白血病发病，其中包括了miR-203，miR-124-1，miR-181a/b，miR-107和miR-42410。 在人类中，有三个独立的miR-9基因（miR-9-1位于1号染色体上；miR-9-2位于5号染色体上；miR-9-3也位于5号染色体上）具有相同的miR-9序列。miR-9即可以是致癌基因的miRNA也可以是抑癌基因的miRNA，取决于癌症或组织类型11。例如，miR-9过表达已被证明能提高乳腺癌细胞或胶质母细胞瘤转移或侵袭，表现为致癌作用，反之，miR-9通过结合于3非翻译区（3非编码区）的NF-B1的mRNA，抑制NFB1翻译卵巢肿瘤细胞，从而抑制细胞增殖，因此表现出肿瘤抑制功能。本实验主要研究miR-9独立基因之一miR-9-3的甲基化。 本实验发现，在I83-E95细胞株miR-9-3完全甲基化导致细胞增殖减少并且增强凋亡。 I83-E95和WAC3CD5+细胞株处理前二者均呈高甲基化状态，而5-AzadC处理后都发生脱甲基化，呈未甲基化状态。这些都说明5-AzaDc具有诱导miR-9-3去甲基化的能力，这种能力可能与5-AzaD降低了miR-9-3表达有关。有人认为5-AzaDc作用机制是先与靶基因结合，再与DNA甲基转移酶结合，形成一个不可逆的复合体，从而阻断甲基转移酶的活性。 有研究表明12，miR-9-3可以通过调控NF-B1蛋白抑制慢性淋巴细胞性白血病细胞的生长，miR-9-3在慢性淋巴细胞性白血病细胞中是低表达的，而增加miR-9-3可以抑制细胞的体外生长，另外miR-9-3直接作用于NF-B1的3UTR区，说明NF-B1是慢性淋巴细胞性白血病中miR-9-3的重要的靶点，当miR-9-3高表达时NF-B1的mRNA和蛋白都被抑制。在慢性淋巴细胞性白血病中是否也存在这种相关，本实验设想通过减弱或抑制miR-9-3的表达，观察其对慢性淋巴细胞性白血病细胞NF-B1的表达，为下一步慢性淋巴细胞性白血病的基因治疗奠定实验基础。 参考文献 1ESTELLERM.EpigeicsincancerJ.NEnglJMed，xx，358：1148-1159. 2CHIMCS，LIANGR，KWONGYL.HypermethylationofgenepromotersinhematologicalneoplasiaJ.HematolOncol，xx，20：167-176. 3JONESPA，BAYLINSB：TheepigenomicsofcancerJ.Cell，xx，128：683-692. 4GONZALEZ-ZULUETAM，BENDERCM，YANGAS，NGUYENTD，etal.Methylationofthe5CpGislandofthep16/CDKN2tumorsuppressorgeneinnormalandtransformedhumantissuescorrelateswithgenesilencingJ.CancerRes，1995，55：4531-4535. 5CHIMCS，PANGR，FUNGTK，CHOICL，LIANGR.EpigeicdysregulationofWntsignalingpathwayinmultiplemyelomaJ.Leukemia，xx，21：2527-2536. 6CHIMCS，FUNGTK，WONGKF，LAUJ，LIANGR：FrequentDAPkinasebutnotp14orApaf-1hypermethylationinB-cellchroniclymphocyticleukemiaJ.JHumGe，xx，51：832-838. 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