抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的鉴定.doc

抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的鉴定 苏琼 连云港中医药高等职业技术学校继续教育处，江苏连云港22xx 摘要目的研究抗人肝癌免疫毫微粒的制备以及对靶细胞的杀伤作用。方法使用异型双工能SPDP对人肝癌以及载阿霉素（ADR）和人血清蛋白微粒进行偶联，通过实验对其的免疫特性进行测试。检测的方法使用法，这种方法的检测对免疫毫微粒是否能够对体外具备杀伤的作用十分有效。检测后在人肝癌老鼠模型上使用HAb18-HSA(ADM)-NS、HSA(ADM)-NS和ADM,来测试其对肝癌的抑制情况。结果HAb18抗体可以偶联到毫微粒上，对体外杀伤的细胞值为45.5g/mL,与ADM的366.1g/mL比较下，明显了降低。免疫毫微粒能够和靶细胞结合并且对靶细胞具有杀伤和选择功能。结论偶联的方法适用制备肝癌免疫毫微粒，并且免疫毫微粒在对抗肝癌治疗上有着明显的效果，值得推广使用。 关键词人肝癌；免疫毫微粒；制备；免疫鉴定 R4A1674-074（4）06（c）180-02 作者简介苏琼（1969.6-），男，江苏宿迁人，本科，讲师，主要从事微生物免疫学教育科研工作。 在我国每年发生肝癌致命的病例有很多，肝癌导致死亡的概率列居肿瘤致死忘总概率的第二。可想而知，肝癌对于人类产生的危害是巨大的，给患者和医师带来了很多困扰。关于治疗肝癌的免疫毫微粒很多专家开始进行研究。具有免疫性的毫微粒具有很大的载药性，而且这种微粒还具有缓释药物，不需要进行偶联的特点，另外，毫微粒在病位进行药物治疗时还具有选择性，因此得到很多专家医生的青睐1，选取xx年3月5月间50只裸鼠为研究对象，现报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料 收集了50只实验裸鼠，鼠龄在48岁之间，裸鼠为BALB/C型老鼠，50只裸鼠是有江西某以医学院提供的。从人肝癌细胞中提取细胞株，ADM-NS的含量控制在34%左右，平均直径在300nm,需要被保存于温度为5的环境下。使用浓度为21mmolPL的异型双功能交联剂实现偶联， 1.2方法 使用异型双工能SPDP对人肝癌以及载阿霉素（ADR）和人血清蛋白微粒进行偶联，通过实验对其的免疫特性进行测试。检测的方法使用MTT法，这种方法的检测对免疫毫微粒是否能够对体外具备杀伤的作用十分有效2。检测后在人肝癌老鼠模型上使用HAb18-HSA(ADM)-NS、HSA(ADM)-NS和ADM，来测试其对肝癌的抑制情况。选用的ADM主要从江苏某制药厂调购过来，抗人体肝癌的抗体由军医院提供。 使用9mL的单抗经0.04molpL,PH值为7.6，在单抗经中加速SPDP10L1，在常温下进行搅拌，搅拌的事件控制在0.5h，然后使用PBS进行洗脱。免疫毫粒选用29mg，进行超生均匀化，和单抗经一样加上同量的SPDP，并且进行30min的搅拌，然后用醋酸溶解液进行清洗，清洗后留下的沉淀就是NP=PDP，把沉淀混入到醋酸液水中放于常温下的室内，这样是为了还原NP-PDP。还原后使用离心洗涤剂进行清洗剩余下来的NP-PDP-SH和Ab-PDP混合，在常温下的室内进行振荡，振荡20h左右后，使用PBS进行多次洗涤，最后剩余的沉淀就是免疫毫微粒3。 1.3主要仪器 制备免疫毫微粒的仪器主要是第二代LXJ离心机，该仪器是由上海某医用工厂生产的；制备过程中使用的搅拌机时由浙江某仪表工产生产的D40-2F电动型搅拌机；观察实验效果采用的显微镜是型号为PM-VBAD的荧光和倒置显微镜，该型号的显微镜是由日本公司生产的；自动定标器是由我国北京某仪器厂生产的型号为FH463A；活度器由CII公司生产的型号为15R活度仪；最后使用的光度仪是由上海分析仪器厂生产的型号为751的紫外线外分光光度计4。 1.4免疫毫微粒免疫性的鉴定 鉴定HAb18-HSA(ADM)-NS时使用的是间接凝结实验，具体做法如下：首先在选用的载波试验片上滴上浓度为505g/mL的HAb18-HSA(ADM)-NS，然后加入选择的裸鼠的抗血清，加入血清后要不间断的进行振荡，同时在光镜下观察其变化情况；免疫荧光：使用502g/mL、101L的HAb18-HSAADM)-NS和IgGh混合，在30min的4温度下进行染色，使用离心洗涤后观察其变化，观察时使用的是前面使用的PM-VBAD的荧光显微镜5；鉴定体外和细胞活性：在SMMC-7721中加入HAb18-HAS(ADM)-NS和HAS(ADM)-NS，加入的两种HAb18-HAS(ADM)-NS，HAS(ADM)-NS浓度均为500g/mL，并且同上在4的室内进行30min反应，然后观察变化；使用扫描电镜观察：取500g/mL的HAb18-HAS(ADM)-NS和SMMC-7721，进行混合，混合后的结合物使用扫描电镜观察。 1.5统计方法 用统计学软件SPSS13.0对所得数据进行处理分析，计量资料以均数标准差（xs）示，进行t检验，计数资料采用2检验。 2结果 通过上述制备免疫毫微粒和鉴定其免疫性质得出结果如下： 首先，对HAb18-HSA(ADM)-NS的载药量以及其微粒的直径鉴定时发现HAb18-HSA(ADM)-NS的载药量达到了34%之多，而且在使用扫描电镜观察HAb18-HSA(ADM)-NS形态时发现其表面十分光滑，形状斯球体，而且各个大小很均匀。调查发现HAb18-HSA(ADM)-NS微粒的平均直径为300nm，图一是其形态。 其次，是单抗体和免疫毫微粒的偶联情况。我们选用的50只裸鼠中，采用裸鼠的抗血清加入到毫微粒后发现，原本分散的毫微粒在加入裸鼠的IgG血清后开始凝集，而没有加入IgG的裸鼠抗血清则是均匀的分散。在加入FITC二抗后，原本光滑的免疫毫微粒的表面开始呈现色度明亮的黄绿色，而没有加入FITC二抗的免疫毫微粒则没有出现荧光色。由此可以看出使用单抗体和毫微粒进行偶联结果是成功的。 另外，关于HAb18-HSA(ADM)-NS的免疫性反应结果如下：在HAb18-HSA(ADM)-NS中加入裸鼠的血清后，HAb18-HSA(ADM)-NS形成颗粒。HAb18-HSA(ADM)-NS和肝癌细胞的结合则出现大量不可散离的HAb18-HSA(ADM)-NS，HAb18-HSA(ADM)-NS可以和肝癌靶细胞能够结合。 最后，HAb18-HSA(ADM)-NS对肝癌体外靶细胞的杀伤性结果：从SMMC-7721细胞在使用各种药物后的反应变化来看，要杀伤一半的体外细胞必须使用浓度在55的ADM，而且，HAb18-HSA(ADM)-NS应该控制在454g/mL,HSA(ADM)-NS为345g/mL，ADM为365g/mL。可见，HAb18-HSA(ADM)-NS对肝癌细胞的杀伤性是强大的。见表1。 3讨论 通过药物来杀伤肿瘤的研究发现，虽然药物可以达到杀伤肿瘤的效果，但是这些药物的不良反应很大。那么对于怎么增加靶细胞药物的浓度同时降低正常组织的药物浓度是目前研究的热点。 现在制备免疫毫微粒的材料也有很多。毫微粒是一种由天然或者合成的高分子形成的颗粒，这种颗粒可以由毛细血管来携带药物进行缓释的作用6。人血清白蛋白毫微粒含有大量游离的羟基及氨基便于交联,且结构清楚,生物性能稳定,为人体自身白蛋白,不会增加过敏反应,为人体理想的药物载体7。通过人肝癌以及载阿霉素（ADR）和人血清蛋白微粒进行偶联是近几年提出的效果显著的方法。在该研究中通过使用SDPP制备免疫毫微粒的结果表明使用SDPP有利于实现单抗体和毫微粒的偶联以制备出免疫的毫微粒8。如今已经有专家在使用SDPP制备免疫毫微粒上取得了巨大的成功。而通过这种方法制备的免疫性毫微粒在杀伤肿瘤时不仅不会给患者带来副作用或者过敏现象，而且能够保证患者身体机能的稳定在这个基础上，使用SDPP的反应来产生NP-PD，然后使用DTT来还原Ab-PDP。该研究在使用化疗性的药物治疗癌症时可以通过加大药物的剂量达到该目的，然后大量的使用化疗药物来杀伤肿瘤以达到治疗目的很容易给患者带来不良反应。那么如何在减少药物的剂量的情况下实现肿瘤治疗效果，很多专家都在进行研究。 通过实验证明HAb18-HAS(ADM)-NS对靶细胞还具有选择性的杀伤力这是ADM以及其他 * 药物所不能比拟的。所以在今后治疗肝癌中，可以采用以上制备免疫毫微粒的方法进行，免疫毫微粒将是有效治疗肝癌的药剂，值得在临床上推广。 参考文献 1HartBA,HintzeenRQ,LamanJD.Preparationofchitosan-polyasparticacid-5-fluorouracilnanoparticlesanditsanti-carcinomaeffectontumorgrowthinnudemiceJ.WorldJGastroenterol,xx,14(22):3554-3562 2刘晓波,蔡美英,黎光,等.抗体介导的阿霉素白蛋白免疫毫微粒的抗人肝癌作用研究J.中华消化杂志,xx，32（1）:58-59. 3阚和平,谭永法,李春芳,等.泰素免疫毫微球的制备及其抗人肝癌效果的动物实验研究J.现代消化及介入诊疗,xx,15（4）:227-229. 4李云春,蔡美英,王仲琼,等.单抗F(ab)_2段导向抗肝癌阿霉素免疫毫微球的制备及其体外杀伤癌细胞作用J.华西医科大学学报,xx（1）:8-11，14. 5ReszkaR,BeckP,FichtnerL,etal.Bodydistributionoffree,lipo-somalandnanoparticle-associatedmitoxantroneinB16-melanoma-bearingmiceJ.JPharmacolExpTher,xx,28(1):232-238. 6朱明明,刘斌,李江.人原发性肝癌中多药耐药相关蛋白MRP的表达、耐药机制及逆转的研究进展J.昆明医学院学报,xx（S1）:202-206. 7赵飞兰.肝癌相关抗原KINECTIN基因的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究D.南宁：广西医科大学,xx. 8RollandA,BourelD,Gee