苏木素伊红染色法开展诱导痰ECP检测对哮喘患儿的诊断价值.doc

苏木素伊红染色法开展诱导痰ECP检测对哮喘患儿的诊断价值 张慧娟廖少羽 【摘要】目的探讨诱导痰ECP检测用于哮喘患儿诊断的临床价值。方法选取xx年2月至xx年6月在我院呼吸科门诊及住院的支气管哮喘患儿92例，按照临床症状及肺功能情况分为哮喘缓解组、轻度间歇组、中重度组，同期选取入院健康体检的正常儿童24例作为对照组，各组患儿均行痰液诱导及收集并进行含量检测，同时检测肺通气功能，对比分析各组间ECP及肺通气功能的差异，探讨ECP含量与肺通气功能指标的相关性。结果哮喘缓解期患儿与对照组ECP水平差异无统计学意义（p0.05），而轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组显著升高（p0.01），且随着哮喘病情的加重而诱导痰ECP含量显著升高；对于肺通气功能指标的检测发现，轻度间歇组及中重度组患儿的FCV、FEV1%较哮喘缓解组、对照组显著降低（p0.05），具有可比性。 1.2研究方法 1.2.1痰液诱导对于痰液的诱导和采集，采用雾化吸入高渗盐水法进行。行痰液诱导前进行肺功能检查，包括一秒最大呼气量（FEV1），以FEV1的下降程度不低于初测值的20%为准，观察患儿是否耐受痰诱导过程，对于FEV1为等于或小于初测值的65%时，须先雾化吸入喘乐宁气雾剂适量，以缓解胸闷、咳嗽等症状，对于FEV1下降50%以上时可嘱患者雾化吸入4%5%的高渗盐水30min，以促进患者肺部痰液的排出，无法自行咳出者可使用吸痰器吸出。本研究参照Pin6等研究报道的方法进行，嘱患儿吸入沙丁醇200g，10min后采用清水漱口并清理鼻腔，后采用5%高渗盐水进行超声雾化吸入，持续20min左右，用力咳出痰液置于培养皿内，至少采集痰液量为0.6ml，4冰箱内保存。 1.2.2痰液质量控制取收集痰液适量，加入4倍体积0.1%二硫苏糖醇（DTT），涡旋震荡以充分混匀，37恒温水浴10min，以裂解糖蛋白纤维丝间的二硫键从而溶解痰液，后采用48m尼龙网过滤，除去黏液和碎片，3000r/min离心10min，分离上清，-80冷冻保存备用，对于细胞沉淀，采用4倍痰液体积的PBS缓冲液重悬，取适量加入新鲜配制的苏木素-伊红染色液进行染色7，光学显微镜下观察细胞活性、细胞计数及鳞状上皮细胞的百分比，其中以细胞活性50%，鳞状细胞计数20%为痰液合格。 1.2.3ECP测定对于ECP的测定，采用夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）法进行，其中，ECPELISA检测试剂盒试验操作严格按照试剂盒说明书进行。 1.2.4肺通气功能测定肺通气功能检测，采用肺功能测定系统按照美国胸科协会(ATS)标准进行，检测前经经验丰富的技术人员进行环境参数、容量定标校准，记录各测试人员的肾功能高、体重等临床资料，并培训相关检测需做的规定动作。测试时嘱患儿上身坐直，头部自然水平，佩戴鼻夹、口器等以包紧口唇，以防漏气，同时要求患儿保持放松，或松解过紧的腰带及衣服领口进行测试。重复测量三次，取最佳值，记录各患儿的用力肺活量(FVC)、一秒钟用力呼气量(FEV1)，计算FEV1.0%（第一秒用力肺活量占用力肺活量的百分比）。 1.3统计学方法 所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行，其中，ECP表达水平、肺通气功能指标等计量资料采用均值标准差表示，组间对比行t检验；对于ECP表达水平及肺通气功能的相关性分析采用Pearson相关性分析，均以p0.05为差异具有统计学意义。 2结果 2.1各组痰液的ECP水平比较 由表1可见，哮喘缓解期患儿虽较对照组ECP水平稍微升高，但差异无统计学意义（t=，P=），而轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组显著升高（p0.01）；对于发病期哮喘患儿而言，中重度组患儿诱导痰液ECP含量高达（152.465.7）g/L，而轻度间歇组患儿为（92.356.2）g/L，组间对比发现，中重度组诱导痰液ECP含量较轻度间歇组显著升高（t=3.130，p=0.003），表明患儿诱导痰液ECP含量随着哮喘病情的加重而显著升高。 2.2各组患儿肺通气功能指标间比较 对于肺通气功能指标的检测发现，对于FCV而言，哮喘缓解组患者与对照组间差异无统计学意义（t=0.222，p=0.825），而轻度间歇组及中重度组患儿较哮喘缓解组、对照组显著降低（p0.01）；对于FEV1%，哮喘缓解组、轻度间歇组、中重度组患儿均较对照组显著降低（p0.05），且随着病情的加重，其下降幅度增加。 2.3ECP含量与肺通气功能指标的相关性分析 对ECP含量与肺通气功能指标行Pearson相关性分析发现，诱导痰液内ECP含量与FVC和FEV1.0%呈负相关性，r值分别为-0.546、-0.573，p均0.01，表明诱导痰ECP含量能够有效的反映肺通气功能。 3讨论 哮喘多以气道慢性炎症、高反应性和气流阻塞为主要临床特征，炎症是导致其发生及发展的关键因素，多种炎症细胞及其分泌的细胞因子、炎症介质都参与哮喘的形成，其中，嗜酸性粒细胞浸润最为显著。嗜酸性粒细胞经活化可分泌ECP，其作为毒性蛋白，可破坏呼吸道上皮组织，使得腺体分泌亢进、血浆渗漏，导致组织胺释放增加，从而导致炎症发生8。近年来，诱导痰液的相关指标检测逐渐广泛应用，其作为直接气道分泌物，对于反映气道炎症具有良好的效果，同时作为非侵入性的检测方法，安全无创，重复性好，且儿童易于接受9。甘明10等在对EOS、ECP及IL-13在哮喘发病机制的作用研究发现，支气管哮喘急性期患者的诱导痰液EOS、ECP含量较健康对照组明显升高（p0.05），与之前文献报道11结果一致，可能是由于患儿个体差异的存在所致；轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组